[發明專利]基于毛細管電泳片段分析和一代測序結合的融合基因核酸檢測方法

在審

• 申請號: 202011585310.6
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112553306A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 劉金超;劉孔尚;劉明坤;葉鋒
• 申請（專利權）人: 北京思爾成生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了基于毛細管電泳片段分析和一代測序結合的融合基因核酸檢測方法。本發明提供了一種檢測多個融合基因的試劑盒，包括多對擴增引物對；每對所述擴增引物由引物A和引物B組成；所述引物A從5'端起依次由用于結合測序引物的接頭序列A和與所述融合基因的靶序列特異結合的特異序列A；所述引物B從5'端起依次由用于調整擴增產物長度的接頭序列B和與所述融合基因的靶序列特異結合的特異序列B；所述引物A的5’端修飾熒光基團。本發明通過將毛細管電泳片段分析和一代測序相結合，實現了基于融合基因核酸的多重檢測和序列的同步獲取，使得在進行基于片段分析的多重檢測的同時，對于陽性融合基因進行一代測序獲取其具體序列。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于毛細管電泳片段分析和一代測序結合的融合基因核酸檢測方法。

背景技術

由染色體變異形成的融合基因通常在腫瘤的發生和進展中發揮著關鍵的驅動作用，越來越多的研究表明，對于融合基因的檢測和鑒定對于腫瘤的診斷、治療、預后評估和后續的微小病變殘留病監測均有重要的意義。當前對融合基因檢測的方法通常有熒光原位雜交技術(FISH)、實時熒光PCR法和下一代高通量測序法等，但這幾種方法都有各自的缺陷或弊端。FISH技術具有操作復雜、人力成本高和通量低的特點；實時熒光PCR法無法獲得具體序列、通量有限的特點；下一代高通量測序法具有準確度偏低、成本較高和需要專業生物信息分析人員等特點。

毛細管電泳是一種高效的生物大分子分離技術，結合熒光標記引物和自動檢測系統，可以高效的自動化檢測核酸等生物大分子片段，可以用來區分不同長度或熒光標記的核酸。而一代測序法是以Sanger測序法為基本原理的核酸序列檢測技術。單獨使用毛細管片段分析只能獲得片段大小，但不能得到具體序列信息；而一代測序法可以獲得序列，但通常只針對單一核酸片段靶標，且操作步驟較繁瑣。

在融合基因檢測中，既需要較高的通量也需要對有必要的融合基因陽性樣本進行序列分析。因此，研究高通量檢測融合基因具有重要的意義。

發明內容

本發明一個目的是提供一種檢測多個融合基因的試劑盒。

本發明提供的試劑盒，包括多對擴增引物對；

每對所述擴增引物對特異擴增1個所述融合基因的靶序列；

每對所述擴增引物由引物A和引物B組成；

所述引物A從5'端起依次由用于結合測序引物的接頭序列A和與所述融合基因的靶序列特異結合的特異序列A；

所述引物B從5'端起依次由用于調整擴增產物長度的接頭序列B和與所述融合基因的靶序列特異結合的特異序列B；

所述引物A的5’端修飾熒光基團；

所述靶序列為包含融合基因中各基因連接位點的序列，即含有融合基因的連接位點的大小為100-300bp的序列，連接位點為融合基因中幾個基因相鄰的位點；

上述試劑盒中，所述熒光基團為FAM、HEX、VIC、TAMRA、ROX或Texred；在本發明的實施方案中，所述5’端引物熒光基團分別為FAM、HEX、TAMRA和ROX基團。

或，所述多對擴增引物對中的接頭序列A均相同，其設計原則和方法為本領域所公知，例如避免引物二聚體、發夾結構等。

或，所述接頭序列A結合一代測序反應的測序引物；在本發明的實施方案中，所述相同接頭均結合通用測序引物M13F或M13R。

或，所述接頭序列B為簡單不易形成二聚體或發夾結構的序列，來區分不同擴增的長度，例如多聚A或C等。在本發明的實施方案中，所述不同長度接頭序列B為不同長度的多聚A。

上述試劑盒中，每對所述擴增引物中的熒光基團相同或不同；