[發明專利]一種臍帶血間充質干細胞培養方法

在審

• 申請號: 202011578876.6
• 申請日: 2020-12-28
• 公開（公告）號: CN112553155A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 刁小娟;劉明媚;王帥;魏于棟;趙丙春;孫旭燕;宋芳;孫健;李小博;楊衛娟;陽浩
• 申請（專利權）人: 山東省齊魯干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 劉紅陽

本發明提供的一種臍帶血間充質干細胞培養方法，通過臍帶血的采集和驗收、臍帶血的洗滌、自體臍帶血富血小板血漿的制備與活化、臍帶血單個核細胞的分離、Transwell小室預處理后培養臍帶血間充質干細胞、臍帶血間充質干細胞的純化及擴增步驟。解決了現有技術必須用一定濃度的胎牛血清培養帶來的各種弊端，并且用自己儲存的富血小板血漿經過活化后培養自己的細胞，效率高、更安全和容易接受。整個過程免去添加各類因子等繁瑣步驟，不僅操作簡便，而且能夠大大節省培養成本。

技術領域

本發明屬于干細胞培養技術領域，具體涉及一種臍帶血間充質干細胞培養方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal stem cell,MSC)可以從多種組織中獲得，如骨髓、臍帶等，它不僅具有多向分化潛能，還可以調節T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞等的免疫學活性。近年來各項研究結果表明，臍帶血中含有多向分化功能的間充質干細胞，其擴增能力是自體骨髓干細胞的幾十倍，并將該細胞命名為臍帶血間充質干細胞。人臍帶血來源間充質干細胞比來源于骨髓、臍帶或其它組織源的干細胞具有優勢，其優勢包括如下幾點：(1)采集臍帶血方便，對供者無任何痛苦，非損傷性采集。(2)臍帶血中免疫系統處于原始階段，移植后排斥反應發生率及嚴重程度較低。(3)臍帶血中各種病毒感染機會相對較少。但臍帶血中間充質干細胞含量極少，每份臍帶血樣本中MSCs的出現頻率為0-2.3個細胞克隆/10⁸MNCs，提取分離有一定難度。目前體外提取培養體系中一般都含有一定濃度的胎牛血清，屬于動物源成分，可能存在動物攜帶的潛在病毒或支原體污染。而且在培養臍帶血間充質干細胞過程中，培養基中一般添加bFGF、EGF、SCF等生長因子，因生長因子價格昂貴，大大增加了培養成本。因此如何分離純化出能夠穩定傳代并且安全、高質量的間充質干細胞具有重要的研究意義。

發明內容

為了克服現有技術中的不足，本發明提供了一種臍血間充質干細胞培養方法的解決方案，具體如下：

一種臍帶血間充質干細胞培養方法，包括以下操作步驟：

(1)臍帶血的采集：將采集后的臍帶血在24小時內放入臍帶血保存液中進行保存，保存溫度為3-5℃；

(2)臍帶血的洗滌：取保存有臍帶血的保存液，混合攪拌均勻后離心處理，然后向離心沉淀中加入清洗液，混合攪拌均勻后再次離心處理，得到上清和沉淀；

(3)臍帶血富血小板血漿的制備與活化：將步驟(2)得到的上清繼續離心后，去掉上部分的血清，中間及底部的沉淀為富血小板血漿，向得到的富血小板血漿中繼續加入氯化鈣溶液，激活處理后，進行離心，得到活化的富血小板血漿，所述激活處理的操作為36.8-37.2℃孵育處理25-35min或者3-5℃的冰箱中冷凍處理15-17h；

(4)臍帶血單個核細胞的分離：將步驟(2)中得到的沉淀中加入杜氏磷酸鹽緩沖液，混合均勻后，加入到淋巴細胞分離液中，吸取白膜層細胞即單個核細胞，將單個核細胞吸至另一潔凈離心管中，加入杜氏磷酸鹽緩沖液重復離心洗滌2-3次，收集底部單個核細胞沉淀，得到臍帶血單個核細胞；

(5)預處理后的Transwell小室培養臍帶血間充質干細胞：將步驟(4)中得到的臍帶血單個核細胞以1×10⁶/cm²的密度接種在預處理后的Transwell小室的下室面，進行培養臍帶血間充質干細胞；

(6)臍帶血間充質干細胞的純化及擴增：細胞培養5-7天后更換完全培養基以棄除未貼壁細胞，后每3-4天半量換液一次，8-12天會發現零星的細胞集落，使用完全培養基擴增細胞得到純化的臍帶血間充質干細胞。

具體地，上述步驟(1)中，每100mL的保存液中含有1.8-2.2g的枸櫞酸三鈉、0.6-1.0g的枸櫞酸、2.1-2.6g的葡萄糖、0.2-0.5g的腺嘌呤、2.8-3.4g的磷酸二氫鈉，所述保存液在使用前經過滅菌處理。