[發明專利]病毒核酸提取或保存試劑、引物探針組合、病毒擴增試劑、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202011532195.6
• 申請日: 2020-12-22
• 公開（公告）號: CN112266986B
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 郭弘妍;王輝;毛沁心;陳翔;徐友春;王會麗;鄧浩浩;李雅婷;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳

本發明涉及病毒檢測領域，特別涉及病毒核酸提取或保存試劑、引物探針組合、病毒擴增試劑、試劑盒及其應用。本發明病毒檢測裝置提供了一種簡單易行的病毒核酸提取方法，整個過程大約5?15分鐘，回收純化的核酸，可用于病毒核酸的檢測。包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等。相比較于傳統的病毒提取方法，本方法病毒核酸回收率高、用時少、操作方便、易于臨床推廣。本發明涉及單管同時檢測新型冠狀病毒COVID?19 N和ORF基因以及人源內參基因的等溫擴增引物、探針組合序列和反應緩沖液，該體系特異性好，靈敏度高（50cp/mL），特異性高，只需20min的檢測時間，最快可在10min左右報陽性。

技術領域

本發明涉及病毒檢測領域，特別涉及病毒核酸提取或保存試劑、引物探針組合、病毒擴增試劑、試劑盒及其應用。

背景技術

新型冠狀病毒是繼2002年暴發的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）和2012年暴發的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）之后，過去20年間在人類中出現的第3種高致病冠狀病毒。核酸的檢測是病原診斷的一個依據，也是目前確診新冠感染的一個重要的依據。因此，開展核酸病毒檢測，也是病毒感染篩查、病毒疾病防控的重要手段。臨床和實際應用過程中，不但對病毒檢測方法的特異性、靈敏度和準確度具有較高的要求，同時對病毒檢測技術的易用性和時效性也提出了較高的要求。此外，對病毒樣本的處理、病毒核酸的提取方法也大大影響病毒的檢測時間和準確度。

目前的高通量新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒基本采用反轉錄加實時聚合酶鏈式反應法（RT-PCR），擴增病原體的核酸(RNA)，同時通過熒光探針實時檢測擴增產物。每個RT-PCR反應需要1.5-2小時的檢測時間，特別是對檢測靈敏度要求較高的(100 cp/mL)，一般需要核酸提取，通常最快3-4小時才可以報告結果。

核酸恒溫擴增技術（Nucleic Acid Isothermal Amplification，NAIA）則是擴增反應的全過程均在同一溫度下進行，對擴增所需儀器的要求大大簡化，反應時間大大縮短，與PCR相比,該技術具有特異性強、敏感性高、簡單便捷和成本低等優點。在病毒核酸檢測，篩查發具有很高的應用價值。然而，目前的恒溫擴增技術均存在以下幾個問題：

（1）目前常用核酸提取技術提取流程復雜、時間長且核酸提取效率較低，無法滿足臨床檢測需求；常用的病毒核酸提取純化技術有Trizol法、離心柱法、磁珠法等方法。Trizol法利用DNA、RNA、蛋白質在有機層和水相層分布位置的不同而分離蛋白質與核酸，在獲得核酸的過程中會用到苯酚、氯仿異戊醇、異丙醇、乙醇等對人體有害的揮發性有機溶劑，對操作人員存在較大的健康危害，且Trizol法提取核酸步驟繁瑣，對不同的樣本提取效果重復性不佳，從樣本裂解到獲得核酸至少需要1.5h，其操作繁瑣、耗時長，不宜在臨床檢測使用。常規的離心吸附柱及磁珠法提取核酸時需要用乙醇或異丙醇進行結合，需要加入乙醇清洗，這種加入醇類清洗的方式使得核酸提取試劑在使用時操作相對復雜，耗時較長，乙醇去除不干凈還會抑制后續反應。

（2）等溫擴增體系擴增效率極高，在對靶標的擴增過程中，不可避免的引入了不必要的非特異擴增，使得結果難以判斷，對于非特異擴增，非特異性熒光染料摻入法對于產物的特異性也無能為力，需要對產物進一步的分析，如cas酶切鑒定等。但涉及開蓋，極易造成氣溶膠污染等環境污染，不利于臨床檢測使用。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了病毒核酸提取或保存試劑、引物探針組合、病毒擴增試劑、試劑盒及其應用。該試劑盒包含特異性好，靈敏度高的擴增引物。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了病毒核酸提取或保存試劑，包括組分1和組分2；

所述組分1包括磁珠；所述磁珠含有oligodT_14-20；

所述組分2為裂解保存液；所述裂解保存液包括如下組分：