[發明專利]利用缺陷型秀麗隱桿線蟲快速檢測牛源志賀菌毒力的方法

在審

• 申請號: 202011516735.1
• 申請日: 2020-12-21
• 公開（公告）號: CN112575055A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 彭昊;李軍;白慧麗;鐘舒紅;李常挺;吳翠蘭;陶立;馮世文
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;A61K49/00
• 代理公司: 南寧啟創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 45122
• 代理人: 謝美萱

本發明公開一種利用缺陷型秀麗隱桿線蟲快速檢測牛源志賀菌毒力的方法，涉及生物模型技術領域，本發明利用對致病菌更為敏感的sek?1、glp?1基因缺陷型秀麗隱桿線蟲，快速、量化檢測牛源志賀菌毒力，且本方法對溫度、致病菌等因素敏感度更高，能高效、高通量地檢測志賀菌的毒力，并運用該方法研究病原菌的致病機制，并進一步做抗菌藥物的篩選，從而為臨床腸道志賀菌病的抗感染治療和用藥提供理論依據。

技術領域

本發明涉及生物模型技術領域，尤其涉及一種利用缺陷型秀麗隱桿線蟲快速檢測牛源志賀菌毒力的方法。

背景技術

志賀菌又稱痢疾桿菌，可分為福氏志賀菌，宋內志賀菌和痢疾志賀菌等，是一種革蘭氏陰性桿菌，有菌毛，無鞭毛，在腸道選擇性培養基上生長為直徑2mm、無色、半透明的光滑性菌落，致病物質主要是侵襲力和內毒素，有的菌株還能產生外毒素，即志賀毒素(Stx)。Stx屬于細菌毒素的一個大家族，會導致嚴重的胃腸疾病，并伴有很高的發病率和死亡率。Stx是已知最強的細菌毒素之一。志賀毒素在疾病中的主要類型是Stx1和Stx2，該毒素會抑制蛋白質合成，最終導致受影響的組織細胞凋亡。牛，山羊等均可感染志賀菌，廣西地區的養牛業是重要的產業支柱，志賀菌的感染會導致牛的腹瀉，并嚴重影響奶制品的質量，給養牛業帶來巨大的經濟損失，因此尋找一種簡單便捷的檢測志賀菌毒力并研究其對牛的致病機理的方法非常有必要。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種生活在土壤中的小型線蟲，以細菌為食，作為一種典型的模式生物，秀麗隱桿線蟲有以下幾個特點：身體透明，結構簡單，顯微鏡下易于觀察；生命周期短，分為4個階段：胚胎發育期、生長發育期、生殖期和生殖后期。在20℃的環境下，3.5d即可完成一個生命周期，可大大縮短試驗時間；基因序列已知，每一個細胞的起源都完全清楚；遺傳序列與哺乳動物有40％的同源性等。這些特性使得秀麗隱桿線蟲與小鼠、大鼠、兔子等實驗動物相比有極大的簡便性和實用性，更節約時間、精力和成本。目前秀麗隱桿線蟲已廣泛應用于毒理學、疾病模型、病原菌致病模型等研究。秀麗隱桿線蟲用于衰老研究、藥物毒理、藥物篩選等的報道屢見不鮮，目前，研究者已建立了50多種線蟲模型，其中包括細菌、真菌和病毒。細菌有鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等。但牛源志賀菌感染秀麗線蟲的致病模型國內尚未見報道。

因此，為了尋找更簡便、快捷研究牛源志賀菌致病機理的方法，為臨床抗感染提供科學的用藥依據，現需研究一種更高效、便捷地檢測牛源志賀菌毒力的方法。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明公開了利用缺陷型秀麗隱桿線蟲快速檢測牛源志賀菌毒力的方法，利用對致病菌更為敏感的sek-1、glp-1基因缺陷型秀麗隱桿線蟲，快速檢測牛源志賀菌毒力，進而研究病原菌的致病機制，并進一步做抗菌藥物的篩選，從而為臨床腸道志賀菌病的抗感染治療和用藥提供理論依據。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種利用缺陷型秀麗隱桿線蟲快速檢測牛源志賀菌毒力的方法，包括以下步驟：

(1)將秀麗隱桿線蟲同期化處理，具體是將其經裂解、離心、沉淀后培養，即可獲得同期化的L4期線蟲；

(2)將志賀菌依次在LB固體培養基、LB液體、SK固體培養基上培養，然后烘干形成菌苔；

(3)將步驟(1)已同期化的L4期線蟲置于含有志賀菌的SK固體培養基中即可。

進一步地，秀麗隱桿線蟲為sek-1，glp-1基因缺陷型秀麗隱桿線蟲。

進一步地，步驟(1)所述裂解時間控制在4min以內，裂解后含蟲卵的液體置于20℃、140-160r/min的搖床中震蕩20±2h。

進一步地，步驟(1)所述離心轉速為1500～3000r/min，離心時間為1～3min。