[發明專利]一種糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解膠體幾丁質上的應用

有效

• 申請號: 202011509092.8
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112553183B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 陳可泉;王成勇;張阿磊;周寧;王瑩瑩;陳燕;陳雪曼;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/26;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 繆友菊

本發明公開了一種糖苷水解酶CmChi3及其在降解膠體幾丁質上的應用。將從土壤中篩選到的菌株Chitinolyticbacter?meiyuanensis?SYBC?H1進行基因組測序分析、克隆CmChi3、構建重組菌株、表達CmChi3蛋白、純化HIS?TAG、并鑒定重組蛋白具有兩個催化結構域，兩個幾丁質結合域，具有內切酶和糖苷水解酶兩種酶的性質，能高效水解幾丁質并以GlcNAc為終產物。此研究預期為單酶法高效生產GlcNAc提供理論依據和基礎。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種糖苷水解酶 CmChi3及其在降解水解膠體幾丁質上的應用。

背景技術

幾丁質（Chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵聚合而成的天然高分子多糖，是地球上含量僅次于纖維素的第二大糖類聚合物，其分子式為(C₈H₁₃O₅N)n，相對分子量在100萬以上。幾丁質在自然界中廣泛存在于真菌細胞壁、昆蟲甲殼及蝦蟹殼中。幾丁質主要來源于蝦蟹殼，使用10%的氫氧化鈉和濃鹽酸對其進行脫蛋白和脫鈣處理后可以得到較高純度的幾丁質。隨著蝦蟹養殖業的發展，產生的蝦蟹殼等下腳料越來越多，而這些下腳料多作為固體廢棄物被丟棄，堆放幾天即會發生腐化并散發出難聞的惡臭，不僅浪費了資源，同時還大大加重了環境負擔。因此，利用幾丁質廢棄物生產高附加值化學品不僅能解決環境問題，還能帶來巨大的經濟效益。

幾丁質作為蝦蟹殼中一個主要的組分，可用來生產多種高附加值的含氮化學品，如N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、幾丁寡糖及其衍生物等。其中，GlcNAc屬于功能性氨基單糖，具有重要的生理功能。目前有許多報道是關于GlcNAc生理活性的應用，比如，GlcNAc對關節炎、類風濕性關節炎、軟骨挫傷、關節損傷和退行性關節病治療也具有增強關節病的治療效果；GlcNAc含有氨基帶正電荷與酸性基團發生反應進而調節細胞周圍的酸堿性，達到抑制癌細胞的增長的作用；GlcNAc作為透明質酸的組成成分，用于護膚品具有很好的保濕效果，通常的添加量為0.1-0.5%。另外還有報道GlcNAc在食品添加劑行業具有廣泛的應用空間。

目前利用幾丁質生產GlcNAc?的方法主要有化學法、物理法和生物酶法?；瘜W轉化法主要是通過濃鹽酸分解幾丁質得到氨基葡萄糖鹽酸鹽，之后進一步乙酰化合成GlcNAc。該方法成本較低，是目前工業化生產GlcNAc的主要手段，但其產物并不認為是天然的GlcNAc，不能作為食品添加劑使用，并且這種方法會產生大量的工業廢水，對環境造成一定的污染。微生物發酵法是目前比較流行的一種方法，通過大腸桿菌的基因工程菌株進行生產GlcNAc。微生物發酵合成法雖然條件溫和，但此法后期分離成本高、難度大，也會造成蝦蟹殼大量的積累。生物酶法是通過酶催化反應，對幾丁質進行酶解，過程綠色、能耗低及專一性強，是實現幾丁質向GlcNAc轉化的最佳途徑，近年來已成為幾丁質降解研究的熱點。

文獻“Production?of?N-Acetyl-d-glucosamine?from?Mycelial?Waste?by?aCombination?of?Bacterial?Chitinases?and?an?Insect?N-Acetyl-d-glucosaminidase[J].?Journal?of?Agricultural??Food?Chemistry,?2016,?64(35):6738.”?中報道Zhu等利用三個細菌來源的重組幾丁質酶?(SmChiA、SmChiB、SmChiC)和一個昆蟲來源的重組N-乙酰氨基葡萄糖苷酶協同降解結晶型幾丁質，24?h?后GlcNAc?與幾丁二糖的比例達93:7。該方法從降解幾丁質獲取GlcNAc需要多種酶的共同作用，成本較高，轉化時間長，無法應用于大規模的生產。