[發明專利]一種Fmoc-賴氨酸高效液相色譜測定方法

有效

• 申請號: 202011504705.9
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112526051B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 徐紅巖;夏偉冬;馬敬祥
• 申請（專利權）人: 上海吉奉生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司 31113
• 代理人: 張勁風

本發明公開了一種Fmoc?賴氨酸高效液相色譜測定方法，主要解決現有Fmoc?賴氨酸色譜分析方法中流動相需要除菌處理導致操作繁瑣的技術問題。本發明測定方法包括以下步驟：一，準備測量的試劑，二，樣品的前處理；三，樣品溶液配制；四，進行高效液相色譜測定，色譜儀為安捷倫1260色譜儀，采用DAD紫外檢測器，安捷倫氨基色譜柱，流動相為質量百分濃度為0.1%TFA水溶液（A）和質量百分濃度為100%乙腈（B），通本發明為Fmoc?賴氨酸系列檢測領域提供了可靠便捷的檢測手段。

技術領域

本發明涉及一種Fmoc-賴氨酸高效液相色譜測定方法。

背景技術

Fmoc-賴氨酸含量測定，有一種比色分析法，需要用到茚三酮顯色劑，而茚三酮顯色劑在常溫下不穩定，需要在冰箱中低溫保存；其次，還需要標準賴氨酸溶液的制備，也有一定的保質期，分析中還用到722分光光度計，操作比較麻煩；也有Fmoc-賴氨酸含量高效液相色譜分析方法， 用到流動相，需要加0.1%TEA溶液，而TEA溶液是由50mM三乙醇胺、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X-100）和氯化鈉組成，屬于HP緩沖液，使用時還要過濾除菌處理，操作比較麻煩。

發明內容

本發明提供了一種Fmoc-賴氨酸的高效液相色譜測定方法，主要解決現有Fmoc-賴氨酸色譜分析方法中流動相需要除菌處理導致操作繁瑣的技術問題。該方法可用于Fmoc-賴氨酸含量的定性分析和定量測定，它不但簡單、準確、可靠，而且可以在短時間內分析Fmoc-賴氨酸的HPLC 分析方法，

本發明采用了以下技術方案：一種Fmoc-賴氨酸高效液相色譜測定方法，包括以下步驟：

步驟一，準備測量的試劑，測量的試劑包括乙腈-色譜純，乙醇、石油醚，超純水；

步驟二，樣品的前處理，反應液加飽和的氯化鈉水溶液溶解，靜止分層，水相再用乙酸乙酯萃取，有機相用鹽水萃取，得到有機相中加入硅酸吸附，然后過濾、濃縮；濃縮樣品再次用乙酸乙酯溶解，冷卻析出固體樣品；

步驟三、樣品溶液的配制，稱取試樣置于棕色容量瓶中，加入乙腈，室溫條件下采用超聲波溶解，用乙腈定容，最后試樣用聚丙烯有機濾膜過濾后進行HPLC分析，當樣品中Fmoc-賴氨酸濃度過高/低時，重新配制標準曲線，使目標化合物落在新的標準曲線的線性范圍內再進行儀器分析計算;

步驟四，進行高效液相色譜測定;色譜測定的的過程為：色譜條件為樣品室溫度為25 ℃，自動進樣器進樣體積為10 μL，色譜柱為：氨基色譜柱，優選安捷倫氨基色譜柱（Agilent ZORBAX SB phenyl） C18 (4.6mm ×250mm, 5.0μm)，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，流動相為質量百分濃度為0.1%TFA水溶液（A）和質量百分濃度為100%乙腈（B）采用梯度洗脫程序，0～2min，V(B)為50%；2～12 min，V(B)從50%到95%，12～12.1 min，V(B)從90% 到50% 的初始比例，12.1～15 min，V(B)從50% 平衡系統；通過對流動相酸度值的控制，不使Fmoc-賴氨酸在色譜柱中分解；即保留時間為7.283 min的色譜峰采集到了Fmoc-賴氨酸的主成份。

所述的液相色譜測定時采用的色譜儀為安捷倫 1260色譜儀，該色譜儀采用DAD檢測器。

本發明具有以下有益效果：本發明方法操作簡便、快速、準確，穩定性好，適用于一種Fmoc-賴氨酸的定性分析和定量檢測，本發明在研究中發現，經過特定的樣品前處理，可以使Fmoc-賴氨酸的樣品在乙腈溶液中為澄清透明溶液。本發明在硅膠吸附時回收率就達到最大值，回收效果最好。本發明的樣品室溫度設定為25℃，有利于樣品室溫的保存，又和柱溫箱的溫度接近，有利于整個液相體系的平穩運行。

附圖說明

圖1為流動相A:B=質量百分濃度0.1%三氟乙酸水溶液: 質量百分濃度0.1%三氟乙酸乙腈的色譜圖。