[發明專利]一種檢測臨床研究血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法

在審

• 申請號: 202011502416.5
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112730653A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 楊勇;陳云輝;鐘勘;姜金方;周茂金
• 申請（專利權）人: 蘇州海科醫藥技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛

本發明涉及一種檢測臨床研究血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法，包括以下步驟：步驟1：血漿樣品前處理；步驟2：色譜分離；步驟3：質譜檢測。本發明的檢測方法具有操作簡單、通量高、靈敏度高、精密性和準確性。

技術領域

本發明涉及一種檢測臨床研究血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法。

背景技術

法匹拉韋為一種RNA聚合酶抑制劑，具有廣譜的抗病毒作用，由日本富士膠片公司開發，2014年3月在日本獲批上市，臨床用于治療各類流感病毒。由于其潛在的治療新型冠狀病毒的療效，2020年2月在中國獲批上市。為了支持法匹拉韋的臨床研究以及仿制藥的研發，需要一種檢測人血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法。目前尚相關技術披露用于檢測法匹拉韋在生物基質中的濃度。液相色譜-串聯質譜聯用法(LC-MS/MS)由于其優異的選擇性、靈敏度、通量及適用性被廣泛的用于生物基質中藥物濃度測定。本發明基于LC-MS/MS技術，開發了檢測臨床研究血漿樣本中法匹拉韋的濃度方法。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種檢測臨床研究血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測臨床研究血漿樣品中法匹拉韋濃度的方法包括以下步驟：

步驟1：血漿樣品前處理，在1.5mL離心管中加入血漿樣品，內標溶液，加入甲醇，渦流振蕩，離心，取出上清轉移至96孔板中，進行LC-MS/MS分析；

步驟2：色譜分離；

色譜條件，色譜柱：Eclipse Plus C18柱，3.5μm，100×4.6mm；進樣量：1μL；柱溫：40℃；流動相A相選用10mM甲酸銨水溶液含0.3％，流動相B項為甲醇，采用體積比為48：52的A：B相等度洗脫；自動進樣器溫度為4℃，流動相的流速為：0.65mL/min；

步驟3：質譜檢測；

質譜條件：電噴霧電離源；電壓為-4500V；離子源溫度為500℃；Curtain Gas和CID壓力分別為40和9psi；掃描模式為-MRM；監測離子反應分別為：法匹拉韋，m/z 156→m/z113；法匹拉韋-15N3，m/z 159→m/z 115；CE為-23eV；DP為-60V；掃描時間為200ms。

優選地，步驟1血漿樣品前處理，取50.0μL血漿樣品，分別加入50.0μL內標工作液、200μL甲醇，渦流10min，以4500rpm轉速離心10min，取出上清200μL轉移至96孔板中，取1.00μL進行LC-MS/MS分析。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：

1、本發明采用簡單的蛋白沉淀法處理血漿樣品，且沒有復雜的濃縮過程，前處理通量較高。

2、本發明檢測方法靈敏度較高，濃度為0.0300μg/mL定量下限樣品信噪比約為45、檢測限經計算約為2.00ng/mL，且色譜進樣量僅為1.00μ/L、柱上法匹拉韋的量為5.00pg。

3、本發明針對檢測法匹拉韋血漿濃度的方法操作簡單、通量高、靈敏度高、精密性和準確性高。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1是本發明法匹拉韋的產物離子全掃描質譜圖；

圖2是本發明的內標法匹拉韋-15N3的產物離子全掃描質譜圖；