[發明專利]一種基因工程菌及其制備方法和在生產半胱氨酸中的應用

在審

• 申請號: 202011500021.1
• 申請日: 2020-12-18
• 公開（公告）號: CN112813012A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 朱永強;潘夢垚;陳召峰;韋光緒;曾慶宇;呂國鋒;陳靜;趙初秋;池圣鋒;楊芝
• 申請（專利權）人: 浙江新和成股份有限公司;上虞新和成生物化工有限公司;黑龍江新和成生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/70;C12P13/12;C12R1/19
• 代理公司: 杭州知閑專利代理事務所(特殊普通合伙) 33315
• 代理人: 萬靜

本發明公開了一種基因工程菌及其在生產半胱氨酸中的應用，該基因工程菌包括宿主細胞和目的基因，目的基因插入至游離型質粒中；或同時插入至質粒和基因組中；插入至質粒中的目的基因主要由按順序連接的trpBA基因和trpB基因構成；插入至基因組中的目的基因為trpBA基因。本發明通過將trpBA基因和trpB基因插入宿主細胞中，得到trpBA基因和trpB基因過表達的基因工程菌，該工程菌能夠表達出特定摩爾比例的α亞基和β亞基，從而使酶法合成L?半胱氨酸的反應中有較高的催化速率和轉化率，其中酶轉化時間縮短至2?8h，L?絲氨酸摩爾轉化率達到95％以上。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種基因工程菌及其在生產半胱氨酸中的應用。

背景技術

L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人體的非必需氨基酸之一，其所帶的巰基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于醫藥領域、化妝品工業、食品領域和飼料添加劑領域等，具有非常廣泛的應用。

根據目前文獻報導L-半胱氨酸的制備方法主要有提取法、化學合成法、和酶轉化法。其中，酶轉化法制備L-半胱氨酸逐漸成為主流技術。

酶轉化法制備的L-半胱氨酸的反應方程式如下所示：

酶轉化法中研究較多的酶是色氨酸合成酶。色氨酸合成酶是具有αββα亞基結構的異質四聚體，其中，α,β亞基分別由trpA和trpB基因編碼。色氨酸合成酶不僅能夠催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸，還能催化L-絲氨酸和硫氫化鈉反應生成L-半胱氨酸。

Ken-ichi Ishiwata(Journal of Fermentation and Bioengineering,67(3):169～172,1989)以L-絲氨酸和硫氫化鈉為底物，色氨酸合成酶酶法合成了L-半胱氨酸，在最佳條件下反應液中L-半胱氨酸達到114g/L，轉化率是以L-絲氨酸和吲哚為底物酶法合成L-色氨酸的47％。日本專利(JP 62215396-A,1987；JP 63007790-A,1988)報道了以L-絲氨酸為底物，以硫化氫或硫氫化物或硫化物為巰基供體，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的工藝。日本專利(JP 62019098-A,1987)以DL-絲氨酸和硫化物為底物，用色氨酸合成酶將L-絲氨酸轉化生成L-半胱氨酸，同時分離制備了D-絲氨酸。

申請公告號為CN102517352B的專利將具有L-色氨酸合成酶活性的濕菌體或粗酶液與含有L-絲氨酸的混合氨基酸料液混合，添加適量硫氫化物或硫化物，25～55℃，pH6～11條件下進行酶促反應，將反應生成的L-半胱氨酸通空氣或滴加雙氧水氧化，等電點結晶法分離得到L-胱氨酸，再經過電解還原制得L-半胱氨酸。其中L-絲氨酸摩爾轉化率達到80％以上。

目前，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的工藝中，酶轉化時間和L-半胱氨酸收率仍有進一步提高的空間。

發明內容

本發明提供了一種基因工程菌及其在生產半胱氨酸中的應用，該基因工程菌能夠通過調控外源導入的trpBA基因和trpB基因的表達水平，控制色氨酸合成酶的亞基摩爾比，從而縮短酶轉化時間，提高半胱氨酸的收率。

具體技術方案如下：

本發明提供了一種基因工程菌，所述目的基因插入至游離型質粒中；或者，目的基因同時插入至游離型質粒和宿主細胞的基因組中；

其中，插入至游離型質粒中的目的基因主要由按順序連接的trpBA基因和trpB基因構成；插入至基因組中的目的基因為trpBA基因；

所述trpBA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，trpB基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。