[發明專利]基于Cy5標記配體的NanoBRET受體結合藥物篩選系統

在審

• 申請號: 202011479932.0
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN112575052A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 呂志良;沈力;孟佳;榮榮
• 申請（專利權）人: 西交利物浦大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/66;C12N15/85;C12N5/10;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了基于Cy5及其衍生物Sulfo?Cy5熒光標記配體的NanoBRET受體結合高通量藥物篩選系統，所述藥物篩選系統包括Cy5及其衍生物Sulfo?Cy5熒光標記配體和表達NanoLuc融合G蛋白偶聯受體的工程化細胞。本發明將NanoLuc融合于受體的N端構建NanoLuc融合受體，配對Cy5及其衍生物Sulfo?Cy5熒光標記的肽類、蛋白質或小分子配體，創立了價廉且靈敏的NanoBRET高通量受體藥物篩選系統。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及基于Cy5或Sulfo-Cy5標記配體的NanoBRET受體結合藥物篩選系統，尤其涉及基于Cy5及其衍生物Sulfo-Cy5熒光標記配體的NanoBRET G蛋白偶聯受體結合高通量藥物篩選系統。

背景技術

G蛋白偶聯受體(GPCRs)是人類基因組中最大的膜蛋白超家族，廣泛分布于神經系統、內分泌系統、心血管系統及免疫系統等幾乎所有的器官和組織中，介導神經遞質和激素的細胞信號轉導，參與調節細胞發育、分化和正常的生理功能活動，與多種疾病的發生、發展密切相關。在目前的臨床用藥中，有約40％的藥物作用于GPCRs，但是只有少數的GPCRs具有相應的臨床藥物(HAUSER,A.S.,CHAVALI,S.,MASUHO,I.,JAHN,L.J.,MARTEMYANOV,K.A.,GLORIAM,D.E.BABU,M.M.2018.Pharmacogenomics of GPCR Drug Targets.Cell,172,41-54)，因此GPCRs仍然是最重要的藥物開發靶點之一(SANTOS,R.,URSU,O.,GAULTON,A.,BENTO,A.P.,DONADI,R.S.,BOLOGA,C.G.,KARLSSON,A.,AL-LAZIKANI,B.,HERSEY,A.,OPREA,T.I.OVERINGTON,J.P.2017.A comprehensive map of molecular drugtargets.Nature Reviews Drug Discovery,16,19-34.；HAUSER,A.S.,ATTWOOD,M.M.,RASK-ANDERSEN,M.,SCHIOTH,H.B.GLORIAM,D.E.2017.Trends in GPCR drug discovery:new agents,targets and indications.Nat Rev Drug Discov,16,829-842.；NIETOGUTIERREZ,A.MCDONALD,P.H.2018.GPCRs:Emerging anti-cancer drugtargets.Cellular Signaling,41,65-74.)。目前靶向GPCRs的藥物研發正在進一步加速。

新藥研發的關鍵問題之一是開發創新的高通量配體鑒定方法，以發現小分子化合物、多肽或蛋白質與受體的結合特性及其藥理活性。傳統的放射性配體受體結合實驗由于存在放射性危害，需要過濾、洗滌去除游離的放射性配體，不適用于高通量藥物篩選。時間分辨熒光能量共振轉移(TR-FRET)是近年來新興的受體結合分析技術(EMAMI-NEMINI,A.,ROUX,T.,LEBLAY,M.,BOURRIER,E.,LAMARQUE,L.,TRINQUET,E.LOHSE,M.J.2013.Time-resolved fluorescence ligand binding for G protein–coupled receptors.NatureProtocols,8,1307.)。Cisbio公司的Tag-Lite專利技術將SNAP融合到GPCRs的N末端，形成SNAP-GPCRs，而SNAP可被含有鑭系元素鋱的熒光基團(Lumi4-Tb)共價標記，從而在細胞膜上得到熒光標記的受體，通過檢測激發受體的熒光基團與加入的熒光配體之間的FRET信號，來測定受體與配體的結合能力。但是這一方法也存在一些缺陷，如費用高昂、本底值高，另外分子內激發過程(電子轉移、FRET、光漂白)以及化合物或蛋白的熒光外部相互作用會對受體或配體產生淬滅效應等，限制了它的廣泛應用。