[發明專利]一種納呋拉啡中間體的生物合成方法及生物酶

有效

• 申請號: 202011474598.X
• 申請日: 2020-12-14
• 公開（公告）號: CN112575011B
• 公開（公告）日: 2022-08-12
• 發明（設計）人: 陳本順;石利平;何偉;李大偉;徐春濤;馬驤;錢若燦;萬新強;張維冰;江濤;尹斌
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/70;C12P17/18
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 張紅艷

本發明涉及藥物合成及酶工程技術領域，尤其是一種納呋拉啡中間體的生物合成方法及生物酶，該方法由化合物II作為起始原料，在緩沖液、助溶劑、輔酶PLP、氨基供體的存在下，經生物酶催化轉化為化合物I，其反應路線為，本發明的合成方法減少了納呋拉啡中間體生產過程中化學催化劑的使用，方法簡單，反應條件溫和，對環境優化，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及藥物合成及酶工程技術領域，具體領域是一種納呋拉啡中間體的生物合成方法。

背景技術

納呋拉啡(Nalfurafine)，成品通常為其鹽酸鹽，2019年9月16日獲得我國藥品監督管理局批準，進入臨床試驗階段。納呋拉啡的分子量：476.6；CAS登記號：152657-84-6，其結構式如下所示：

Nalfurafine是原研公司是日本的Toray，是一款kappa opioid receptor(KOR)受體激動劑。其軟膠囊劑型已自2009年起于日本出售，其口腔崩解片更方便患者服用，于2017年在日本獲批并推出。血液透析患者所患的瘙癢癥屬于非發炎性，十分普遍且癥狀嚴重。包括抗組胺藥在內的傳統止癢劑在多數情況下無法抑制瘙癢。數據顯示，尿毒癥瘙癢在透析前患者中發病率為15％-49％，而在血液透析及腹膜透析患者中發病率為50％-90％。透析預后及實踐模式研究(DOPPS)的結論表明：有約42％的透析病人受中度到重度皮膚瘙癢的困擾。這不僅嚴重影響到患者的生活質量，若干患者甚至出現焦慮、抑郁或失眠癥狀。鹽酸納呋拉啡可用于治療血液透析相關尿毒癥綜合征瘙癢，同時在慢性肝病患者瘙癢癥的治療中也有應用。

納呋拉啡中手性基團的引入至關重要，在專利WO2010144641中提及了一種手性氨基的引入方法，具體路線如下：

該方法中手性氨基的引入需要金屬釕的參與，反應條件苛刻，使用大量有機溶劑，手性催化率不高，在經濟成本增加的同時，對環境造成污染。因此需要開發出一種簡單易行、條件溫和、對環境友好的的合成路線。

發明內容

本發明的第一目的在于提供一種生物酶。

本發明的第二目的在于提供上述生物酶的制備方法。

本發明的第三目的在于提供采用上述生物酶進行納呋拉啡中間體生物合成的方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種生物酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述生物酶的工程菌制備方法為：

以pET-28a質粒為載體，表達所述生物酶基因。生物酶基因連接到pET-28a質粒的EcoR I和Hind III位點，然后轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。

具體地，將所述生物酶基因進行全合成后設計上下游引物F1、R1(如SEQ ID NO：2-3所示)進行PCR擴增，PCR條件為：98℃3min，95℃30s，57℃90s，72℃90s，35個循環；PCR擴增體系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，滅菌的雙蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；

采用膠回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，電泳檢驗回收產物的濃度；EcoRI，Hind III酶切膠回收產物及pET-28a質粒，膠回收試劑盒對酶切后的膠回收產物進行純化和回收，膠回收試劑盒對酶切后質粒進行純化回收，電泳檢驗回收產物的濃度；目的基因tra-07與載體pET-28a連接，連接體系：目的基因4μL，載體pET-28a 2μL，Buffer 2μL，連接酶1μL，16℃過夜連接；將構建好的載體通過轉化技術導入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培養箱中過夜，將長出來的單菌落進行質粒提取和測序，最終獲得含生物酶基因的重組工程菌：Escherichia coli工程菌TRA-07。