[發明專利]一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法

有效

• 申請號: 202011472450.2
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN114636781B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 何景昌;王靖宇;任煒瑩;田云;劉利波
• 申請（專利權）人: 北京泰德制藥股份有限公司
• 主分類號: G01N30/96
• 分類號: G01N30/96;G01N30/64;G01N30/08;G01N30/06;C07K1/113
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本發明公開了一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法。該方法包括以下步驟：糖蛋白變性、收集濃縮、酶切糖鏈、沉淀、糖鏈富集、離子色譜分析。本發明利用高效陰離子交換色譜法檢測糖蛋白寡糖的唾液酸化水平，克服了傳統標記操作步驟復雜、高唾液酸化糖鏈標記效率低等難題，能夠精確分析糖蛋白的寡糖圖譜，更有利于對各唾液酸化組分進行精確分析，適用于糖蛋白寡糖唾液酸水平的評價。

技術領域

本發明涉及蛋白質醫藥生物工程與技術領域，涉及一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法。尤其涉及一種重組人血管內皮細胞生長因子受體Fc（VEGFR-Fc）融合蛋白寡糖唾液酸化水平的評價方法。

背景技術

糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，按照連接方式的不同，可分為N-糖基化和O-糖基化，其中N糖基化是糖鏈與編碼蛋白氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr（X為除Pro以外的氨基酸）中Asn殘基上的-NH₂相連，O-糖基化是糖鏈與編碼蛋白氨基酸序列Ser/Thr殘基上的-OH相連。目前，治療性蛋白藥物大都由基因重組細胞表達，其糖基化類型及水平對藥物在體內的藥效、半衰期、穩定性和安全性等均有不同程度的影響。如對于單克隆抗體或融合蛋白，末端較低唾液酸水平，都會影響藥物效應動力學（pK），導致體內的快速清除，半衰期縮短，因此，唾液酸水平是評價糖基化水平的一個重要指標。其中寡糖圖譜能夠展示糖蛋白帶有不同唾液酸數的糖型分布，計算不同唾液酸數的糖型比例，Z值是表征糖蛋白整體唾液酸化程度的一個重要參數。該檢測項目主要用于表征重組治療性糖蛋白的唾液酸化程度及考察批間糖基化穩定性。

目前，寡糖圖譜（Z值）測定方法主要有高效液相色譜法和離子色譜法。高效液相色譜法測定Z值的方法需要進行2-AA/2-AB標記，存在操作步驟復雜（2-AB法）、高唾液酸化糖鏈標記效率低（2-AA法）等問題，而本方法采用的離子色譜檢測原理是基于含有不同數量唾液酸的糖鏈所帶電荷不同，使用陰離子色譜柱將含有不同唾液酸數的寡糖分離，再用高靈敏度的積分脈沖安培檢測器檢測，樣品不需要標記，操作簡單，靈敏度高，能更加真實反映VEGFR-Fc融合蛋白的唾液酸化程度，最終檢測結果以Z值體現，Z值定義為每個寡糖中唾液酸的平均數。這有助于對復雜糖蛋白進行唾液酸化程度深入分析，有助于研究不同電荷異構體之間唾液酸化程度的差異，更有利于生產工藝過程中對不同唾液酸化的糖蛋白進行質量控制。

發明內容

重組人VEGFR-Fc融合蛋白為同源二聚體糖蛋白，由中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）表達，并經高度純化和病毒滅活步驟獲得。該蛋白含有多個糖基化修飾位點，具有多種電荷異構體，IEF上顯示為不少于12條條帶（見附圖1），不同條帶的差異主要由唾液酸引起。為保證各生產批次唾液酸化程度的一致性，需要穩定的生產工藝和有效的唾液酸化分析方法。為了進一步對產品進行質量研究，并對純化過程進行精細控制，提高產品質量，本文通過鹽酸胍和DTT將糖蛋白進行變性還原，并對變性后的蛋白使用糖苷酶F進行酶切、醇沉、濃縮干燥和重懸，結合高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測器（HPAEC-PAD）對富集的糖鏈進行寡糖圖譜檢測分析，用于指導純化過程中目的蛋白的收集，達到獲得高質量糖蛋白藥物的目的。

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法，該方法克服了2-AB法操作步驟復雜、2-AA法高唾液酸化糖鏈標記效率低等難點，可以對糖蛋白寡糖圖譜（Z值）進行分析，能夠精確分析糖蛋白的唾液酸化程度和不同唾液酸化的寡糖差異，有助于純化過程中目的蛋白的收集，達到獲得高質量糖蛋白藥物的目的。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法，該方法采用高效離子色譜法進行分析，具體包括如下步驟：

（1）使用變性劑和還原劑對蛋白進行變性還原，對變性還原后的蛋白進行烷基化處理；

（2）對烷基化后的蛋白進行換液，并收集至離心管中濃縮；

（3）將濃縮后的蛋白使用糖苷酶F進行酶切；