[發明專利]一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法

有效

• 申請號: 202011472450.2
• 申請日: 2020-12-15
• 公開（公告）號: CN114636781B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 何景昌;王靖宇;任煒瑩;田云;劉利波
• 申請（專利權）人: 北京泰德制藥股份有限公司
• 主分類號: G01N30/96
• 分類號: G01N30/96;G01N30/64;G01N30/08;G01N30/06;C07K1/113
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1.一種評價糖蛋白寡糖唾液酸化水平的方法，該方法采用高效離子交換色譜法進行分析，具體包括如下步驟：

(1)使用變性劑和還原劑對蛋白進行變性還原，對變性還原后的蛋白進行烷基化處理；

(2)對烷基化后的蛋白進行換液，并收集至離心管中濃縮；

(3)將濃縮后的蛋白使用糖苷酶F進行酶切；

(4)在酶切后的蛋白溶液中加入有機溶劑，沉淀，離心，取上清液；

(5)對步驟（4）中所得的上清液進行濃縮干燥，重懸，得待測的寡糖溶液；

(6)使用高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測器對步驟（5）中的寡糖溶液進行檢測分析，其中色譜柱為?Dionex?CarboPac?PA200?3*250mm?，保護柱為?Dionex?CarboPacPA200?Guard?3*50mm?；

其中高效離子交換色譜法采用梯度洗脫，洗脫條件如下：

流動相A：0.02M氫氧化鈉溶液，

流動相B：0.1M氫氧化鈉溶液，

流動相C：0.1M氫氧化鈉+1M醋酸鈉溶液，

洗脫梯度如下：

其中所述的糖蛋白為重組人VEGFR-Fc融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1）中使用的變性劑為鹽酸胍或尿素。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1）中緩沖體系為Tris-HCl緩沖液，還原劑為二硫蘇糖醇，烷基化試劑為碘乙酰胺。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1）的變性可通過以下方式實現：取適量重組人VEGFR-Fc融合蛋白，加入1M?Tris-HCl緩沖液、8M鹽酸胍和1M?二硫蘇糖醇，使最終體系中蛋白濃度在0?.5-1mg/ml、Tris-HCl終濃度為50mM、鹽酸胍終濃度為6M和二硫蘇糖醇終濃度為10mM，混勻后，于56℃水浴30min；

所述的步驟（1）中使用二硫蘇糖醇溶液對糖蛋白進行還原處理，加入二硫蘇糖醇溶液的濃度為0?.5M-1M，對蛋白進行還原處理的二硫蘇糖醇終濃度為2-25mM；步驟（1）中使用碘乙酰胺進行烷基化處理，其中所用的碘乙酰胺的濃度為5-62.5?mM。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟（1）中對蛋白進行還原處理的二硫蘇糖醇終濃度為5-20mM。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2）中使用脫鹽柱或超濾離心管進行換液。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（3）中所用糖苷酶F的終濃度為2-?20U/μl。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的步驟（3）中所用糖苷酶F的終濃度為4-?10U/μl。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（4）中蛋白沉淀所用有機溶劑有甲醇、乙醇或丙酮。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述的步驟（4）中蛋白沉淀所用有機溶劑有乙醇或丙酮。

11.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（4）中所用有機溶劑的體積比為50%?-?80%。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述的步驟（4）中所用有機溶劑的體積比為65%?-?75%。

13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于所述的步驟（4）中所用有機溶劑是75%體積比的乙醇。