[發(fā)明專(zhuān)利]CLTX-NKG2D雙特異性嵌合抗原受體細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011471739.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112500497B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 代紅久;徐慧;李曉宇;朱靚婧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京凱地醫(yī)療技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864;C12N7/01;C12N5/10;A61K39/00;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02;A61P37/02;A61P31/04;A61P31/
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

本發(fā)明屬于嵌合抗原受體細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種靶向人CLTX?R和NKG2DL的雙特異性嵌合抗原受體的編碼氨基酸序列，及其修飾的免疫應(yīng)答細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種雙特異性靶向人NKG2DL和氯毒素受體（CLTX?R）的蛋白或其功能性變體的雙特異性嵌合抗原受體，其修飾的免疫應(yīng)答細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用；獲得的新型功能化免疫應(yīng)答細(xì)胞能有效地靶向攻擊多種腫瘤，及制備用于治療惡性腫瘤的制劑。本發(fā)明的靶向CLTX?R和NKG2DL的雙特異性嵌合抗原受體修飾的免疫應(yīng)答細(xì)胞能增強(qiáng)與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，明顯提高抗腫瘤活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于嵌合抗原受體細(xì)胞領(lǐng)域，涉及一種靶向人CLTX-R和NKG2DL的雙特異性嵌合抗原受體的氨基酸編碼序列、及其修飾的免疫應(yīng)答細(xì)胞，以及它們的制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，免疫細(xì)胞治療已成為癌癥治療領(lǐng)域的第四大療法。

癌癥免疫療法主要包括過(guò)繼性細(xì)胞治療、免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤疫苗以及免疫結(jié)合點(diǎn)阻斷治療等。其中，在細(xì)胞治療領(lǐng)域，CAR-T療法無(wú)疑已成為研究機(jī)構(gòu)和制藥公司爭(zhēng)相“追捧”的明星。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞)為代表的免疫療法，其原理主要是通過(guò)基因工程手段對(duì)病人自身提取的T細(xì)胞進(jìn)行嵌合抗原受體的修飾形成CAR-T細(xì)胞，該T細(xì)胞能特異性地識(shí)別腫瘤表面相關(guān)抗原(腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物)，從而靶向殺傷腫瘤。

近年研究表明，NKG2DL蛋白的表達(dá)是細(xì)胞處于“應(yīng)激狀態(tài)”的一個(gè)指標(biāo)，其在健康組織中很少有表達(dá)或僅短暫地表達(dá)，而通常在不同來(lái)源的各種腫瘤細(xì)胞表面有較高水平的表達(dá)。NKG2DL蛋白的受體為NKG2D，研究顯示，NKG2D-NKG2DL系統(tǒng)在機(jī)體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，NKG2D通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面產(chǎn)生的NKG2DL來(lái)傳遞活化信號(hào)并激活免疫系統(tǒng)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病患者的血清中含有可溶性NKG2DL，NKG2D-NKG2DL系統(tǒng)在治療自身免疫性疾病、抗炎、抗衰老等方面起到一定作用(參見(jiàn)Legroux L等人，F(xiàn)rontiers in Immunology，(2019))。因此，NKG2DL的表達(dá)作為機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)腫瘤細(xì)胞上的一個(gè)特異性的改變，為腫瘤的免疫治療提供了一個(gè)更為精確的靶點(diǎn)，為相關(guān)新療法和藥物的開(kāi)發(fā)提供了啟示。

據(jù)報(bào)道，氯毒素(chlorotoxin，CLTX)可以與多種膜蛋白結(jié)合，CLTX-R為CLTX的受體，包括MMP-2、CLCN3、ANXA2等，具體為膜相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、氯離子通道CLCN3和磷脂蛋白annexin A2(ANXA2)(參見(jiàn)Wang等人，Sci.Transl.Med.，2020)。CLTX被證實(shí)可廣泛且特異性地結(jié)合膠質(zhì)瘤和其他神經(jīng)外胚層腫瘤，同時(shí)與腦和其他部位的非惡性細(xì)胞表現(xiàn)出極低的交叉反應(yīng)性。一些胚胎相關(guān)腫瘤，包括黑素瘤，也被證明表達(dá)MMP-2并結(jié)合CLTX。CLTX本身對(duì)腫瘤和正常組織無(wú)細(xì)胞毒性，可以安全地用于特異性靶向腫瘤。有研究表明CLTX-CAR T細(xì)胞治療原位異種移植瘤模型小鼠可使腫瘤消退，CLTX-CAR T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞或在過(guò)繼轉(zhuǎn)移到小鼠后均不表現(xiàn)出可觀察到的脫靶效應(yīng)活性。

綜上所述，我們構(gòu)建了基于NKG2D-NKG2DL系統(tǒng)的激活性靶標(biāo)NKG2D和使用CLTX及其突變肽作為靶向腫瘤區(qū)域的雙特異性嵌合抗原受體修飾的新型高特異性殺傷力的免疫應(yīng)答細(xì)胞用于腫瘤的治療。

發(fā)明內(nèi)容