[發明專利]一種檢測松材線蟲的HDA等溫擴增試劑檢測方法

在審

• 申請號: 202011459471.0
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112458187A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 紀國彬;程維金;張叔勇;羅治建
• 申請（專利權）人: 保綠豐（湖北）生物科技有限公司;武漢市林業工作站
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844
• 代理公司: 深圳紫晴專利代理事務所(普通合伙) 44646
• 代理人: 付欽偉

本發明提供一種檢測松材線蟲的HDA等溫擴增試劑盒及檢測方法，該試劑盒主要由以下幾種試劑組成：試劑A：松材線蟲組織裂解液；試劑B：HDA等溫擴增緩沖液，其中含有特定引物BxHDAF及BxHDAR；試劑C：HDA等溫擴增反應酶液，其中含有解旋酶。擴增產物經電泳檢測，出現目標電泳條帶即可確定檢測樣本中有松材線蟲存在，所說的目標電泳條帶是指97bp處。使用本試劑盒，按本發明所提供的方法，可快速、靈敏、準確地檢測并判斷松材中線蟲是否為松材線蟲。

技術領域

本發明涉及一種原生動物基因組核酸診斷試劑盒，尤其涉及一種松材線蟲基因診斷試劑盒及檢測方法。

背景技術

松材線蟲病，又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲引起的具有毀滅性的森林病害，屬我國重大外來入侵種，已被我國列入對內、對外的森林植物檢疫對象，該病自1982年傳入我國以來，擴散蔓延迅速，目前全國已有14省(市、區)發生，面積達7.7萬hm2，導致大量松樹枯死，對我國的松林資源、自然景觀和生態環境造成嚴重破壞，造成了嚴重的經濟和生態損失，該病的顯著特征是，被侵染的松樹針葉失綠，并逐漸黃萎枯死變成紅褐色，最終全株迅速枯萎死亡，但針葉可長時間內不脫落，有時直至第二年夏季才脫落，從針葉開始變色至全株死亡，平均只有30天左右，病樹大多在9月至10月上、中旬死亡。

松材線蟲在我國尚未得到有效控制，目前疫區仍在不斷擴大之中，雖然目前已經有熒光定量PCR等技術可在標準參考實驗室用于檢測松材線蟲，但是各地野保及林業基層部門仍然急需一套適用于基層部門的松材線蟲快速檢測技術，因此我們提出一種松材線蟲基因診斷試劑盒及檢測方法，用于解決這個問題。

發明內容

(一)解決的技術問題

本發明的目的是填補現有技術的空白，提供一種松材線蟲基因診斷試劑盒及檢測方法。

(二)技術方案

一種松材線蟲基因診斷試劑盒(簡稱本試劑盒)

本試劑盒主要由以下幾種試劑組成：

試劑A：松材線蟲組織裂解液，為2.5mmol/L DTT、1.125％Tween20、0.025％Gelatin緩沖液；

試劑B：HDA等溫擴增緩沖液，其中含有特定引物BxHDAR及BxHDAF；其序列為：

BxHDAR 5′-CAAAGCCCAAGAGCGCAATATGCATTC-3′；

BxHDAF 5′-GGGTCGATGAAGAACGCAGTGAATTGC-3′。

試劑C：HDA等溫擴增反應酶液，其中含有大腸桿菌解旋酶Ⅱ(UvrD)解旋酶及BstDNA Polymerase。

試劑D液：陽性對照，為松材線蟲陽性DNA模板。

試劑C與試劑D中分別所含的特定引物BxHDAR和BxHDAF，應有足夠的含量，—般應不少于8pM。

與現有技術相比，本發明提供了一種檢測松材線蟲的HDA等溫擴增試劑檢測方法，具備以下有益效果：

1、該檢測松材線蟲的HDA等溫擴增試劑檢測方法，能快速、靈敏、準確地檢測出松樹是否攜帶松材線蟲，且已經用本發明對松樹是否被松材線蟲感染進行檢測，得出有效、可靠的檢測結果。

2、該檢測松材線蟲的HDA等溫擴增試劑檢測方法，適用于檢測松材線蟲。

附圖說明

圖1為PCR產物電泳結果圖；圖1中1、2、3依次為200bp ladder DNA分子量Marker、陽性對照和等溫擴增產物。

具體實施方式