[發明專利]一種木霉屬真菌rpb2分子標記基因簡并引物組及其應用

在審

• 申請號: 202011454080.X
• 申請日: 2020-12-10
• 公開（公告）號: CN112375841A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 蔡楓;伊瑞娜·杜魯茲尼娜
• 申請（專利權）人: 奧世利華（蘇州）微生物科技研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州欣達共創專利代理事務所(普通合伙) 32405
• 代理人: 周升銘

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種木霉屬真菌rpb2分子標記基因簡并引物組及其應用。本發明公開的簡并引物組，針對木霉屬真菌rpb2分子標記基因的保守區域設計，可高效、精確、特異地進行擴增木霉屬真菌rpb2標記基因的有效片段，極大地提高了擴增成功率和精確度，解決了針對子囊真菌設計的現有引物擴增困難，擴增產物不特異，擴增產物冗長的問題。本發明公開的PCR反應體系，模板濃度需求低，檢測下限為0.032ng/μl模板DNA，檢測線低，檢測結果靈敏，鑒定成功率高。本發明所述的木霉屬真菌菌種鑒定方法，電泳后不需純化可直接用于測序，鑒定效率高。所述的木霉屬真菌菌種鑒定試劑盒，成分簡單，操作方便，適合大量樣本檢測，實用性好，經濟及市場價值高。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種木霉屬真菌rpb2分子標記基因簡并引物組及其應用。

背景技術

木霉(Trichoderma spp.)是工農業生產重要的發酵和植物有益菌種，屬于子囊菌門(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)，是一類普遍存在且易于分離的絲狀真菌。

木霉屬真菌因其卓越的纖維素分解能力而廣泛應用于工業酶制劑和生物燃料領域；又因其獨特的對植物病原真菌抑制作用和對植物的促生能力而作為生物肥料或菌劑大量應用于農業生產。目前，已知報道的木霉屬真菌已超過400 種，但并不是所有的木霉種菌株都具有工農業開發價值，因此，很有必要對獲得的菌株進行精確的菌種鑒定。

然而，現行用于木霉屬真菌菌種鑒定的主要分子標記之一rpb2基因的引物并不是針對木霉屬真菌設定的，是現有文獻Liu J.Yajuan,Whelen Sally,Hall D.Benjamin.(1999)Phylogenetic relationships among Ascomycetes: evidence from an RNAPolymerse II Subunit.Mol.Biol.Evol.16(12):1799 –1808.(對比文件1)中Liu等人針對子囊真菌(Ascomycetes)設計的，因此，該對引物在應用于木霉屬真菌時，常會出現擴增困難無條帶、擴增產物不特異、擴增產物冗長等一系列問題，給木霉菌種鑒定工作者帶來巨大困擾，同時也嚴重阻礙了木霉屬真菌種質資源的進一步發掘。

由于現行使用的可用于木霉屬真菌rpb2分子標記擴增的引物除Liu等人 (對比文件1)設計的引物外并無其他相對較成功的引物對，因此，rpb2分子標記基因擴增一直是掣肘木霉屬真菌菌種鑒定的瓶頸之一。

發明內容

本發明為了解決現有沒有木霉真菌rpb2的簡并引物擴增時存在擴增失敗、，且相應的擴增產物存在較多非特異擴增而導致測序失敗的技術問題，公開了以下技術方案：

本發明公開了一種木霉屬真菌rpb2分子標記基因保守區域包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述SEQ ID NO.1為5’端序列：5’-ATGCGNAGRRTGAAYACBGARYTGGCHA-3’，所述SEQ ID NO.2為3’端序列：5’ -ATYATYCCYTTCCCYGATCRHMACCAGGTA-3’；

其中，N＝A/T/G/C，R＝A/G，D＝G/A/T，Y＝C/T，W＝A/T，B＝C/G/T，S＝C/G，H＝T/C/A， K＝G/T,M＝A/C。

本發明還公開了一種簡并引物組，包括序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，所述SEQID NO.3為正向引物，核苷酸序列為：5’-ATGCGNAGRRTGAAYACBGA-3’；所述SEQ ID NO.4為反向引物，核苷酸序列為：5’-RTTRTGRTCDGGRAADGGAATR-3’；其中，N＝A/C/G/T，R＝A/G，Y＝C/T，B＝C/G/T，D＝A/G/T，優選的，用于擴增權利要求1所述的木霉屬真菌rpb2分子標記基因保守區域。