[發明專利]枯草芽孢桿菌人工終止子及其應用

有效

• 申請號: 202011451933.4
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112481265B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 周哲敏;崔文璟;林巧;胡瑞淳;肖琪;朱怡炫;溫云哲;劉續;鐘先格
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/56;C12N9/88;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了枯草芽孢桿菌人工終止子及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明首先對不同的終止子的活性進行表征，接下來使用不同終止子測定平臺對終止子的終止次效率進行測定，得到了一系列可提高目的蛋白產量的新型終止子，以綠色熒光蛋白基因作為終止子上游基因，以紅色熒光蛋白基因作為終止子下游基因，表征終止子對上下游基因的調控水平。結果表明，這些新型終止子對于提高上游基因表達量和抑制下游基因表達量都有良好的效果。將一系列不同終止子應用于納豆激酶和普魯蘭酶重組蛋白表達中，結果表明，這些終止子有助于提高蛋白的酶活和蛋白表達量的提升，這對在枯草芽孢桿菌中生產目的蛋白具有重要的應用價值。

技術領域

本發明涉及枯草芽孢桿菌人工終止子及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

轉錄終止子是位于基因或操縱子的下游，負責RNA聚合酶的解離和釋放出轉錄的RNA從而起到終止轉錄的一段RNA序列。在原核生物中，轉錄終止子有兩種類型，一種是蛋白因子依賴型，需要在蛋白因子的輔助下才能發揮作用，且消耗ATP；另一種是不依賴任何蛋白因子，僅依賴其自身的反向回文序列和poly-U形成的發夾結構發揮作用，也稱為內在終止子。轉錄終止子由于其特殊的二級結構，常位于基因的3’端，因此在維持mRNA穩定性和提高mRNA的半衰期方面起到重要作用。終止子終止轉錄是使RNA聚合酶脫離轉錄復合物，可提高RNA聚合酶的利用效率，也能提高基因的表達量。之前，對于終止子的研究主要集中在大腸桿菌當中，只有小部分文獻提及在其他微生物中的應用，如釀酒酵母等。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主。因此，提供一種能夠調控枯草芽孢桿菌中基因表達、穩定、高活性的終止子，對于制備目的蛋白，尤其是食品領域中用到的蛋白，具有重要的應用價值，因此如何得到一種高效的、兼容性好的、可調節蛋白表達的枯草芽孢桿菌人工終止子系統成為研究的熱點。

發明內容

為了得到一種高效的、兼容性好的、可調節蛋白表達的枯草芽孢桿菌人工終止子系統，本發明提供了一種調控基因表達的元件，所述元件為T5、T24、T31、T42、T52終止子，核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。

上述終止子在基因表達中的應用，所述應用為，將終止子置于需表達的基因的下游，與基因共表達。

在本發明的一種實施方式中，所述基因為編碼納豆激酶的基因，或編碼天冬氨酸裂解酶的基因。

本發明還提供了一種含有上述元件的載體。

本發明還提供了表達上述載體的基因工程菌。

本發明還提供了一種調控枯草芽孢桿菌中目的蛋白表達的方法，將上述元件與目的蛋白基因共表達。

在本發明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB400、Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis WB800。

在本發明的一種實施方式中，所述目的蛋白包括酶。

本發明還提供了上述的調控元件或基因工程菌在制備目的蛋白中的應用。

本發明還提供了上述的調控元件或基因工程菌在食品、制藥或化工領域的應用。

有益效果