[發(fā)明專利]一種Treg細(xì)胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011443820.X
• 申請(qǐng)日: 2020-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN112626027A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段海峰;薛冰華;于婷婷;解晶;劉麗華;龐如夢(mèng);陸穎;張超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京雙因生物科技有限公司;北京匯智馳康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/0783;C07K14/54
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N表達(dá)IL?10和IL?37的間充質(zhì)干細(xì)胞，以及使用該間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)treg細(xì)胞的方法和相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)容器及應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)和免疫治療領(lǐng)域，具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N使用表達(dá)I IL-10和IL-37的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)Treg細(xì)胞的方法以及相應(yīng)培養(yǎng)工具。

背景技術(shù)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T細(xì)胞亞群，能夠抑制免疫反應(yīng)的細(xì)胞群，在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反應(yīng)和維持機(jī)體免疫平衡方面發(fā)揮重要的作用。雖然在外周血細(xì)胞所占的比例低，僅占正常人外周血、脾臟組織CD4+T細(xì)胞的5％～10％，但是與腫瘤、自身免疫病、移植物的接受性等有密切的關(guān)系。

體內(nèi)存在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量很少，僅占正常人外周血淋巴細(xì)胞的1-2％，體外獲取后數(shù)量少，純度不高，且細(xì)胞增殖能力低。因此，探索體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增高純度調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，建立更有效的細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法，并在短期內(nèi)獲得有功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，是順利開展免疫檢查點(diǎn)與共刺激信分子抗體藥物體外功能實(shí)驗(yàn)的重要前提。

正常人外周血中存在的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量?jī)H占CD4+T細(xì)胞的5-10％。傳統(tǒng)Tregs細(xì)胞體外擴(kuò)增多使用磁珠分選獲得純度較高的Tregs細(xì)胞后，添加IL-2，IL-15，IL-33等細(xì)胞因子，并添加anti-CD3/CD28磁珠刺激增殖。傳統(tǒng)的CD25+CD4+Treg分離方法不但獲取細(xì)胞數(shù)量少，而且純度低，尤其是體外擴(kuò)增過(guò)程中真正起抑制作用的Treg并沒有得到有效擴(kuò)增，以至于最終獲得的細(xì)胞中Treg數(shù)量非常少，無(wú)法順利進(jìn)展后續(xù)的體外功能實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，傳統(tǒng)Tregs體外擴(kuò)增方法成本較高，且生物安全性有待考究。而如何選擇合適的分選標(biāo)志物，加入哪些激活物與細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖，確保擴(kuò)增后細(xì)胞的純度和功能，是目前急待解決的問(wèn)題。因此，建立成本低、生物安全性的Treg細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，才能滿足大量的臨床輸注需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明針對(duì)一種外周血來(lái)源調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，通過(guò)直接獲得外周血的單個(gè)核細(xì)胞，并將其鋪于含有特定基因修飾的飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并添加IL-2及TGFβ等，誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞的擴(kuò)增。因?yàn)椴捎煤屑?xì)胞因子的MSC飼養(yǎng)層包被皿進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，就可以在減少后續(xù)試劑的添加，也不需要對(duì)源頭細(xì)胞進(jìn)行額外的CD4+CD25+雙陽(yáng)性細(xì)胞分選，從而降低的培養(yǎng)成本。

一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于表達(dá)IL-10和IL-37。

進(jìn)一步地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述IL-10序列為SEQ ID NO.1或其變體；

進(jìn)一步地，所述IL-37序列為SEQ ID NO.3或其變體；

進(jìn)一步地，所述IL-10和IL-37基因序列為SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4或其變體；

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜鲩g充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)免疫細(xì)胞中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述免疫細(xì)胞為Treg細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述免疫細(xì)胞為CD4+CD25+CD127low表達(dá)的Treg細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用中間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝薚reg細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于使用上述間充質(zhì)干細(xì)胞作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)Treg細(xì)胞。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于包括上述間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器為培養(yǎng)瓶。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝松鲜黾?xì)胞培養(yǎng)容器在培養(yǎng)NKT細(xì)胞中的應(yīng)用。