[發明專利]基于納米金的分裂型適體傳感器及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011437992.6
• 申請日: 2020-12-11
• 公開（公告）號: CN112630439A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 姜利英;任林嬌;秦自瑞;張培;孟曉龍;徐曉萍;張吉濤;陳青華
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/573;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 冉珊敏

本發明屬于傳感器領域，涉及分裂型適體傳感器，特別是指基于納米金的分裂型適體傳感器及其制備方法和應用。本申請基于能量轉移原理，利用納米金淬滅FAM熒光基團；結合分裂型核酸適體識別機制，構建了一種基于納米金的高靈敏分裂型適體傳感器。對傳感器制備條件進行實驗優化，如AuNPs與P2的結合過程中的檸檬酸鈉用量、AuNPs與P2的比例、工作溶液的穩定時間等。利用優化后的工作溶液檢測ATP，結果表明該傳感器檢測范圍為30pmol/L到15 nmol/L，高靈敏線性檢測范圍為30pmol/L到3330pmol/L，檢出限為30pmol/L，且具有良好的特異性，是一種極具應用潛力的分裂型適體傳感器。

技術領域

本發明屬于傳感器領域，涉及分裂型適體傳感器，特別是指基于納米金的分裂型適體傳感器及其制備方法和應用。

背景技術

三磷酸腺苷(triphosadenine，ATP)是生物體內各種生命活動能量的直接來源，在生化反應和藥物分析中起著關鍵的作用。常見的心血管病、帕金森綜合征和阿爾茲海默癥都與ATP濃度密切相關，檢測ATP濃度在病理和生命科學研究中具有重要意義。傳統檢測ATP的方法主要依賴于昂貴的儀器設備，如高效液相色譜法、同位素示蹤法等，雖然靈敏度較高，但樣品制作要求高，實驗操作繁瑣，儀器昂貴等缺點限制了其推廣應用。

核酸適體（aptamer）是指經體外篩選技術SELEX(指數富集配體系統進化)篩選出的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的寡聚核苷酸片段（RNA或DNA），具有易合成、易標記、性質穩定、沒有免疫源性和毒性等優勢。適配體與靶標結合后，其構象通常發生顯著變化，形成發夾、莖環、假結或膨出結構，利用核酸適體與靶標結合后構象變化或結構修飾，結合熒光分析技術的高靈敏性可設計多種熒光適體傳感器。但是在復雜的基質中，結構的改變容易受到一些干擾因素的影響，可能產生虛假的陽性或非特異性信號，影響傳感器的特異性和靈敏度。為此，Stojanovic等在提出了一種分裂型核酸適體的方法，將核酸適體分裂為兩個片段P1和P2，在靶目標存在的情況下形成P1-靶標-P2三明治結構。由于這兩個獨立的寡核苷酸片段缺乏二級結構，因此不會產生假陽性或非特異性信號。利用分裂型適體設計熒光傳感器的方法有很多，You等和Jiang等利用氧化石墨烯或碳納米管作為淬滅劑，淬滅P1上修飾的熒光信號；加入P2與靶標后，形成P1-靶標-P2三明治結構，熒光恢復，根據恢復熒光信號的多少可測量加入靶標的濃度，ATP檢出限為20μmol/L，茶葉堿的檢出限為155nmol/L、4nmol/L。Wang M利用納米金淬滅熒光恢復檢測ATP的檢出限為5μmol/L。還有人利用無標記的方式結合分裂型適體檢測ATP，檢出限最低為2.67 nmol/L；將DNA分子設計與核酸外切酶等與分裂型適體結合檢測ATP，檢出限為1-30μmol/L。分析以上研究發現，分裂型核酸適體檢測ATP的檢出限一般比較高，不利于低濃度的ATP檢測，這是由于核酸適體分裂后，特異性增強，但其與靶標分子的親和力相對減弱，濃度過低時，由于空間位阻作用，難以將溶液中微量的ATP分子捕獲。有研究者通過多種分子修飾（ATP檢出限2.4 nmol/L）、化學過程變化（ATP檢出限0.02nmol/L）等增強反應過程，有效降低了分裂型適體傳感器的檢出限，但傳感器制備過程復雜，操作難度高且相對成本較高。

發明內容

為解決上述技術難題，本發明提出一種基于納米金的分裂型適體傳感器及其制備方法和應用。

本發明的技術方案是這樣實現的：

基于納米金的分裂型適體傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將核苷酸鏈P2加入Tris-HCl溶液中反應2h進行激活，得P2溶液；

（2）向P2溶液中加入AuNPs，常溫反應20min后，再加入檸檬酸鈉溶液并在37℃恒溫振蕩培養3 h，再離心取底液即得到AuNPs@P2耦合物；

（3）向AuNPs@P2耦合物中加入核苷酸鏈P1，室溫培養2h，即得基于納米金的分裂型適體傳感器工作液。