[發明專利]一種鐵皮石斛母瓶苗生產方法

在審

• 申請號: 202011430986.8
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112544446A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 黃偉鵬
• 申請（專利權）人: 浙江坤極生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.一種鐵皮石斛母瓶苗生產方法，包括如下步驟：

步驟1)：將鐵皮石斛蒴果消毒及干燥；

步驟2)：將鐵皮石斛蒴果內的種子接種于1代半固體培養基中培養；其中所述1代半固體培養基由如下原料制成：以1/2MS培養基作為基本培養基、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇以及1～2g/L瓊脂，pH 5.8～6.0；

步驟3)：將步驟2)中的鐵皮石斛種子混懸液轉接并均勻鋪在2代母瓶苗培養基中進行培養；其中所述2代母瓶苗培養基由如下原料制成：以1/2MS培養基作為基本培養基、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、0.1g/L肌醇、5g/L瓊脂以及8％～10％香蕉泥，pH6.0～6.2。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟1)的鐵皮石斛蒴果消毒及干燥具體步驟為：取鐵皮蒴果，先用洗衣粉浸泡10-15min，再用自來水沖洗5min，然后用75％乙醇消毒3min，無菌水沖洗3次，0.1％氯化汞溶液消毒25min，然后用無菌水將殘留的升汞沖洗干凈，消毒完畢后置于超凈臺上晾干，裝入無菌紙袋中；將無菌紙袋放入30℃的烘箱中干燥，直至重量沒有變化；將種子袋置于陰涼干燥整潔的環境中保存，待用。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟2)中在配置1代半固體培養基時需要預先按照MS培養基配方進行母液配制，包括配制MS大量元素母液、MS鈣鹽母液、MS維生素母液、MS微量元素母液、MS鐵鹽母液；然后精確量取25mLMS大量元素母液、25mLMS鈣鹽母液、10mLMS維生素母液、10mLMS微量元素母液、5mLMS鐵鹽母液，加入30g蔗糖和0.1g肌醇溶解，另稱量1～2g瓊脂粉加適量水煮沸溶解后加入混合，定容到1L；然后通過滴定1mol/L NaoH或者1mol/L HCl調節pH到5.8～6.0；將調節好pH的培養基分裝到廣口瓶中，每瓶分裝75mL，置于高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，滅菌條件為117℃，30min；將滅菌完畢的培養基放置到接種緩沖間冷卻待用。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟2)中將鐵皮石斛種子接種培養具體操作步驟為：鐵皮石斛種子接種是在無菌超凈臺上進行的，其中超凈臺在使用前打開紫外照射0.5h以上，使用時關掉紫外燈，打開普通光照燈；鐵皮石斛種子接種前首先點燃超凈臺內的酒精燈，然后用酒精棉對操作的雙手及伸入的手臂進行擦拭消毒及對操作桌面進行擦拭消毒；在這基礎上將接種所需的鑷子、剪刀、勺子等工具置于酒精燈上滅菌，滅菌時間為15～30s；取滅菌干燥完畢的接種盤于超凈臺上，將勺子置于其內，用鑷子取出消毒干燥完畢的鐵皮石斛蒴果置于勺子上，然后左手用鑷子夾住果柄，右手用剪刀剪開蒴果，將種子抖落在勺子上，將鐵皮石斛種子接種于1代半固體培養基培養基中培養；接種完畢后用手緩慢搖晃廣口瓶使得種子充分與培養基混勻，最后將廣口瓶放置于培養室中培養。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：在配置所述2代母瓶苗培養基時，首先需要預先配制MS培養基中各成分母液，包括MS大量元素母液，MS鈣鹽母液，MS維生素母液，MS微量元素母液，MS鐵鹽母液、配置NAA母液、準備泥漿狀香蕉；然后精確量取25mLMS大量元素母液、25mLMS鈣鹽母液、10mLMS維生素母液、10mLMS微量元素母液、5mLMS鐵鹽母液，80～100g香蕉打成的香蕉泥、2mL NAA母液、30g蔗糖和0.1g肌醇加入溶解，另精確稱量5g瓊脂粉加適量水煮沸溶解后加入混合，定容到1L；通過滴定1mol/L NaoH或者1mol/L HCl調節pH到6.0～6.2；將調節好pH的培養基分裝到蘭花瓶中，每瓶分裝150-200mL，然后置于高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，滅菌條件為117℃、30min；將滅菌完畢的培養基放置到接種緩沖間冷卻待用；其中，NAA母液配置方法為：稱量100.0mg NAA，先用少量95％乙醇溶解，再用去離子水定容到1000ml，配成100mg/L濃度的NAA母液；泥漿狀香蕉：精確稱量剖皮的香蕉80-100g，置于打漿機加適量水打成泥漿狀。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述步驟3)中鐵皮石斛種子混懸液轉接是在無菌超凈臺上進行的，其中超凈臺在使用前打開紫外照射0.5h以上，使用時關掉紫外燈，打開普通光照燈；其中移液槍一直置于超凈臺紫外消毒滅菌；在轉接前前要對接種培養瓶口用酒精棉擦拭，打開擦拭完畢的廣口瓶，然后將其瓶口置于酒精燈外焰環繞滅菌約15s；再用移液槍吸取2.5ml鐵皮石斛種子混懸液接種于2代母瓶苗培養基中，轉接完畢后輕輕晃動蘭花瓶，使得種子混懸液均勻鋪在培養基表面，最后將蘭花瓶放置于培養室中培養；培養室培養120d左右即可作為母瓶苗用于轉接培養。