[發明專利]一種SARS-CoV-2N蛋白IgA的間接ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 202011426611.4
• 申請日: 2020-12-09
• 公開（公告）號: CN112881681A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 柳燕;任翠平;周暢;瞿明勝
• 申請（專利權）人: 安徽醫科大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種SARS?CoV?2 N蛋白IgA的間接ELISA檢測方法，包括（1）包板、（2）封閉、（3）一抗孵育、（4）二抗孵育、（5）棄去酶標二抗，TMB單組分顯色液100μl/孔，37℃避光顯色5 min，每孔加入ELISA終止液50μl，震蕩混勻，采用終點法，檢測波長450nm，參比波長630nm，酶標儀檢測450nm吸光度值。本發明使用NP?IgA ELISA檢測sIgA，可以盡快輔助診斷，這對于有效干預和隔離患者，防止感染進一步擴散具有重要意義。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，涉及一種SARS-CoV-2N蛋白IgA的間接ELISA檢測方 法。

背景技術

新冠狀病毒(2019-nCoV)被稱為嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)， 引起冠狀病毒疾病2019(COVID-19)。SARS-CoV-2通過飛沫傳播，也可能通過糞口途徑傳 播。COVID-19病例發病癥狀為干咳、發熱、渾身酸痛無力、腹瀉，病情嚴重的病例的臨床表現為高熱、呼吸困難、血氧水平低，死亡病例多數死于呼吸衰竭以及細胞因子風暴導致的多器官衰竭。

雖然國內疫情已經得到良好有效的控制，但仍舊有很多問題需要深入的研究。目前，幾 種基于聚合酶鏈反應(PCR)的技術檢測病毒RNA是確定新冠病毒感染診斷的主要方法，但 是基于呼吸道標本的核酸檢測陽性率低，單一的核酸檢測結果可能會造成新冠病人漏診，需 要開發其他方法對核酸檢測進行補充，同時，實時熒光定量PCR(quantitativereal-time PCR RT-qPCR)只能檢測標本中是否存在病毒，但并不能反映病例的體液免疫應答情況。

高免疫原性的N蛋白是病毒血清學診斷的重要抗原。它參與RNA包裝和病毒顆粒釋放， 并干擾宿主細胞的細胞周期過程。SARS-CoV-2的N蛋白的N端結構與其他冠狀病毒的N蛋 白相似，但它們之間的表面靜電電位特性不同。通過對N蛋白生化性質的表征分析，發現N 蛋白在溶液中主要是一種二聚體，55℃時結構最好，具有非特異性核酸結合能力。COVID-19 感染患者血清中存在抗N抗原的IgA、IgM和IgG抗體。這些引起了人們對其作為診斷標記物的注意。

SARS-CoV-2的特異性抗體，如IgG、IgM等，在免疫分析中的應用遠高于IgA。然而，分泌型IgA抗體在預防呼吸道感染方面非常有效。先前對SARS-CoV的研究顯示IgA、IgM 和IgG的動力學相似。因此，IgA檢測作為一種特殊的診斷標志物是一種很有吸引力的選擇。血清學診斷檢測IgA已有報道，但COVID-19患者的痰液或咽拭子中分泌型IgA的實時變化尚未知。

發明內容

本發明的目的在于提供一種SARS-CoV-2N蛋白IgA的間接ELISA檢測方法。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供的技術方案是：一種SARS-CoV-2N蛋白 IgA的間接ELISA檢測方法，包括下列步驟：

步驟1：將采用pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋的新冠病毒核衣殼蛋白(NP)加入酶標 板，每個反應孔100μL，4℃過夜，次日用PBST緩沖液清洗酶標板反應孔3-5次，每次4-6分鐘；

步驟2：向酶標板的反應孔加300μL的質量分數為5％的脫脂奶粉溶液作為封閉液進行封 閉，4℃孵育18小時；

步驟3：棄去酶標板的反應孔中液體，用PBST緩沖液清洗酶標板反應孔3-5次，每次4-6分鐘；然后向反應孔分別加待檢測樣品100μl，同時設立空白，陽性和陰性對照，37℃濕盒孵育1.5h；所述待檢測樣品為待檢測的不同稀釋度的血清、痰液或咽拭子；

步驟4：棄去酶標板的反應孔中液體，用PBST緩沖液清洗酶標板反應孔3-5次，每次4-6分鐘；每個反應孔添加PBST稀釋的HRP-山羊抗人IgA 100μl，37℃溫育1h；