[發(fā)明專利]一種對光敏感的BV2工具細胞及其構建方法和應用

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• 申請日: 2020-12-08
• 公開（公告）號: CN114606268A
• 公開（公告）日: 2022-06-10
• 發(fā)明（設計）人: 呂澤中;詹陽
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 深圳智趣知識產權代理事務所(普通合伙) 44486
• 代理人: 崔艷崢

本發(fā)明公開了一種對光敏感的BV2工具細胞及其構建方法和應用，所述構建方法通過慢病毒工具為載體，將帶有光感基因ChETA和熒光基因EYFP的質粒整合在BV2細胞的基因組內，使用藍光(450?490nm)刺激，即可特異性激活光刺激區(qū)域的BV2工具細胞，BV2工具細胞相關離子通道開放，產生去極化現象。本發(fā)明的對光敏感的BV2工具細胞可以在體外特異性的光激活，靈敏性高，在體外研究小膠質細胞的發(fā)育、行為和功能方面具有重要意義。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞生物學領域，特別涉及一種對光敏感的BV2工具細胞及其構建方法和應用。

背景技術

小膠質細胞(Microglia)是中樞神經系統(CNS)中最小的一種神經膠質細胞，分布于整個中樞神經系統，約占膠質細胞總數的5％-10％。作為常駐中樞神經系統的免疫效應細胞，小膠質細胞隸屬于單核吞噬細胞族，被廣泛地認為是中樞神經系統的主要免疫效應器，小膠質細胞及其介導的神經炎癥在中樞神經系統的損傷及疾病的轉歸過程中起著非常重要的作用，參與諸如HIV腦病、帕金森病、阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化等人神經系統紊亂疾病。

BV2作為中樞神經系統內的免疫細胞，既可通過吞噬腦組織中的病原體及有害顆粒對神經元起保護作用，又可在致炎因子的作用下，激活成反應性小膠質細胞，分泌炎性細胞因子對神經元起毒性作用，是治療神經炎癥及神經退行性疾病的一個重要靶點。BV2細胞系為Blasi等在1990年應用攜帶癌基因v-raf/v-myc的反轉錄病毒J2感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質細胞而獲得的永生細胞系，該細胞系不僅高度純化，而且基本具備了原代培養(yǎng)的小膠質細胞的形態(tài)學、表型以及各項功能特點，相對較易培養(yǎng)，是世界上目前使用最為廣泛的體外研究小膠質細胞的細胞系。

傳統的影響B(tài)V2細胞的興奮性和調控細胞膜離子通道開放的方法，多通過離子通道的興奮劑和抑制劑完成，然而，離子通道的興奮劑和抑制劑多不具有組織特異性和小膠質細胞選擇性，具有副作用大等缺點。因此，目前缺乏一種能夠被選擇性特異調控且可視化的BV2工具細胞。

發(fā)明內容

針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明提出了一種對光敏感的BV2工具細胞及其構建方法和應用，所述構建方法通過慢病毒作為載體，攜帶帶有光感基因ChETA和熒光基因EYFP的質粒對BV2細胞進行轉染，獲得一種對光敏感的BV2工具細胞，所述對光敏感的BV2工具細胞在體外研究小膠質細胞的發(fā)育、行為和功能方面具有重要意義。

本發(fā)明提供一種對光敏感的BV2工具細胞的構建方法，包括如下步驟：

(1)構建依次連接有啟動子、光感基因ChETA和黃色熒光標記基因的慢病毒基因載體質粒；所述啟動子為CMV、EF1a、iba-1、cx3cr1、CAG、TEF1中的任意一種，所述黃色熒光標記基因為EYFP；

(2)將步驟(1)中所述的慢病毒基因載體質粒和pDelta 8.74輔助質粒、pMD2.G質粒一起轉染包裝細胞，培養(yǎng)，裂解包裝細胞，用氯仿、氯化鈉和PEG8000純化，取上清液，所述上清液中含有用于感染BV2細胞的慢病毒，所述慢病毒中包括依次連接的啟動子、光感基因ChETA和黃色熒光標記基因；本發(fā)明的轉染步驟中不需要通過脂質體進行轉染，可簡化實驗操作的流程，節(jié)約成本。

(3)用步驟(2)中所述慢病毒感染BV2細胞，得到所述對光敏感的BV2工具細胞。通過實驗觀察，獲得的對光敏感的BV2工具細胞中在藍光刺激下能發(fā)出熒光的細胞比例高達100％，全部細胞都能夠在藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。獲得的BV2工具細胞可以穩(wěn)定傳代，且在傳代過程中熒光不隨傳代次數增加而減弱，轉入的光感基因也不丟失。

進一步的，所述步驟(1)中所述的慢病毒基因載體質粒為pLenti，所述載體如圖2所示。使用CMV作為啟動子，后接ChETA光感基因，其后接EYFP熒光標記基因。當光感基因ChETA表達時，細胞會發(fā)出黃色熒光。

進一步的，所述步驟(2)中所述的包裝細胞為HEK293、293T、AAV293中的任意一種。