[發明專利]一種快速檢測乙型肝炎病毒前S2抗原的磁性免疫層析試紙條及方法

在審

• 申請號: 202011409627.4
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112557661A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 盧瑛;蔡楊楊
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 上海唯智贏專利代理事務所(普通合伙) 31293
• 代理人: 吳瑾瑜

本發明具體涉及一種可以快速定性、定量檢測乙型肝炎病毒前S2抗原的磁性免疫層析試紙條及檢測方法。試紙條的檢測線為乙肝前S2抗原?牛血清白蛋白偶聯物，質控線為鼠IgG。首先通過預孵育處理，將樣品中的乙肝前S2抗原和抗體及偶聯了羊抗鼠二抗的免疫磁珠反應，避免了固定化抗體的空間位阻效應，使得抗原與抗體間的結合更加充分；然后采用磁性免疫層析試紙條檢測。本發明通過將磁性納米材料表面修飾的特異性單克隆抗體改為通用性強且易于獲取的二抗，降低了檢測成本，并利用二抗的信號放大效應提高了檢測靈敏度；此外，本發明利用磁信號的穩定、可準確定量特點，在肉眼快速定性檢測乙型肝炎病毒前S2抗原的同時，還實現了準確、靈敏的定量檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術和檢測領域，具體涉及一種適用于低成本快速檢測乙肝前S2抗原的磁性免疫層析試紙條的制備及其應用方法。

背景技術

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的肝臟感染，是嚴重危害人類身體健康的傳染性疾病。據WHO統計，全世界約有20億人曾感染過乙肝，目前有約3.78億慢性HBV患者，每年HBV新發感染約450萬例，其中約1/4將發展成為各種肝臟疾病，并最終死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發性肝細胞癌。而我國正是HBV感染的中高流行區，我國乙肝人群中乙肝表面抗原(HBsAg)的攜帶率高達8％-10％，幾乎達世界HBsAg的總攜帶量的三分之一，HBV的感染率、發病率、患病率等長期以來均排名世界前列。

慢性乙肝感染往往不表現任何特異性癥狀，患者感到明顯不適就醫時病情常已發展到中重度階段，因此乙肝的早期檢測對于患者和風險人群來說意義重大。乙肝血清學早期檢查最重要的一項血清學指標是乙肝表面抗原(HBsAg)，它是HBV外殼的主要成分，包含大、中、小蛋白三種形式。中蛋白較小蛋白所增加的片段稱為乙肝前S2抗原，大蛋白較中蛋白所增加的片段稱為乙肝前S1抗原。其中乙肝前S2抗原完全暴露于HBV外層，且具有聚合人血清白蛋白受體，有助于HBV吸附于肝細胞表面，有研究認為其比乙肝前S1抗原和HBsAg更能敏感反映HBV在肝細胞中的活動性復制，其在急性乙肝中可早于其于血清ALT升高前11周出現，是HBV早期感染的一項標志，也是判斷乙肝慢性化和嚴重程度的一項指標。

近些年來隨著臨床醫學、免疫學和分子生物學的不斷發展，眾多高靈敏度的新型檢測手段如化學發光、時間分辨熒光、表面增強拉曼光譜等技術開始在乙肝檢測中得到應用，但與其他乙肝血清標志物相比，目前臨床上乙肝前S2抗原的診斷技術研究較少，方法不成熟，基本只能做到定性判斷陰陽性結果，因此亟需開發相關定量產品。現有專利CN203337669U僅提出了一種基于金標免疫層析法(GICA)同時定性檢測前乙肝前S1和前S2抗原聯檢卡的構建方法，但未得到完善，也未進一步分析檢測性能。CN104297483A、CN105652001B、CN207396502U也存在類似的問題。CN103293295A公開了一種檢測乙肝前S1抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法，但僅使用T線信號值作為定量依據，也未使用臨床真實血清樣本驗證。CN104730237A公開了一種可用于檢測甲胎蛋白、乙肝表面抗原及HIV抗體的試紙條方法，其結合化學發光及免疫層析技術，檢測靈敏度高，但操作繁瑣，檢測時需在試紙條上施加發光液，也僅實現了乙肝表面抗原的半定量分析。CN109884306A公開了一種小分子檢測試紙條、試劑盒及其檢測方法，雖然采用了預孵育的方式，但是其仍然采用了標記單抗的模式，相較于本發明不能有效降低昂貴單抗的使用量。

傳統試紙條一般采用標記物上偶聯對應檢測物質的特異性單克隆抗體(單抗)直接結合待測物質的策略，單次制備過程中抗體的使用量約為10-200μg，成本高昂，不利于前期產品開發。且由于目標抗原和抗體的結合在試紙條的結合墊上完成，因此還存在抗體活性降低、反應時間短、結合不充分的問題。因此，需要對現有技術加以改進，提供一種低成本的檢測方法和試劑，能夠快速定性/定量檢測乙型肝炎病毒前S2抗原。

發明內容