[發明專利]一種肺動脈組織單細胞懸液及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011401085.6
• 申請日: 2020-06-09
• 公開（公告）號: CN112481195B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 楊媛華;繆冉;鐘久昌;翟振國;董星琲;龔娟妮;李一丹;萬鈞;郭曉娟;王劍鋒;王瑩;楊蘇喬;李積鳳;鄺土光
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京驥馳知識產權代理有限公司 11422
• 代理人: 唐曉峰

1.一種肺動脈組織單細胞懸液，其按照下述的方法制備和任選地檢測，所述方法特征在于包括以下步驟：

1)選取肺動脈內膜淡黃色組織成分作為組織標本；

2)將選取的組織標本放入組織保存液保存；

3)用酶解液1處理步驟2)獲得的組織標本，所述的酶解液1是在1640培養基中加入膠原酶I及CaCl₂，處理溫度為30-40℃；

4)向酶解液1中加入DNAaseI，充分消化組織；

5)過濾經處理的樣品，收集細胞，并加入酶解液2進一步酶解，所述的酶解液2中包含膠原酶I、膠原酶II、膠原酶XI、彈性蛋白酶和DNAaseI；

6)過濾步驟5)獲得的樣品，重懸后，加裂紅液，消除紅細胞的干擾；終止裂紅后，離心收集；

7)用去死細胞的磁珠來重懸細胞，室溫孵育，加入到潤洗后的磁珠柱中，收集過濾得到的溶液，離心；

8)重懸細胞，并稀釋成不同濃度；

9)任選地，選擇“AO/PI活率”測定，來檢測細胞濃度和活率。

2.如權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中步驟3)所述的膠原酶I的終濃度為2.5mg/mL。

3.如權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中步驟3)所述的處理溫度為37℃。

4.如權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中步驟4)所述的DNAaseI終濃度是50U/mL。

5.如權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中步驟5)所述的酶解液2是通過向1640培養基中加入終濃度為1mg/ml膠原酶I、1mg/ml膠原酶II、0.2mg/ml膠原酶XI、1.8U/ml彈性蛋白酶、50U/ml DNAaseI及2.5mMCaCl₂制成的。

6.根據權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中所述的肺動脈內膜淡黃色組織成分由手術獲得，并需經分離、清洗、修塊，盡可能去除剝脫組織內血性血栓成分以及肌化的內膜組織。

7.根據權利要求1所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中所述的過濾步驟經由濾網進行。

8.根據權利要求1-7中任一項所述的肺動脈組織單細胞懸液，其中各步驟在無菌條件下進行。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的肺動脈組織單細胞懸液在單細胞測序中的應用。

10.權利要求9所述的肺動脈組織單細胞懸液的應用，其中，將制備的單細胞懸液應用于10x Genomics平臺，進行文庫構建，獲取測序質控數據、序列數據和單細胞基因表達數據，從而完成單細胞水平的基因表達檢測。