[發(fā)明專利]一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011383917.6
• 申請(qǐng)日: 2020-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112553163A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁炳煥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 翁炳煥
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N15/867;C12N15/113;A61K48/00;A61K31/713;A61K35/28;A61P31/14
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1.一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，將新冠病毒的易感基因ACE2插入干細(xì)胞DNA中，制備易被新冠病毒感染的易感干細(xì)胞，進(jìn)而將新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干擾序列shRNA插入所制易感干細(xì)胞DNA中，構(gòu)建既能通過(guò)ACE2將新冠病毒吸入干細(xì)胞內(nèi)又能通過(guò)shRNA靶向干擾新冠病毒在干細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的RNA干擾干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，所述干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、肺干細(xì)胞或誘導(dǎo)肺干細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，所述插入基因包括重組慢病毒載體的構(gòu)建、重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝、干細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染、RNA干擾干細(xì)胞的篩選和鑒定。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，所述重組慢病毒載體的構(gòu)建包括將新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干擾序列shRNA和/或?qū)⑿鹿诓《疽赘谢駻CE2克隆到慢病毒載體的多克隆位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列見(jiàn)“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候選序列”。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，擴(kuò)增所述hACE2基因的上游引物為：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物為：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分別為：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種hACE2敲入的新冠病毒RNA干擾干細(xì)胞，其特征在于，按以下步驟制備：

(1)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞：從干細(xì)胞樣本庫(kù)或日常實(shí)驗(yàn)后剩余的樣本中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞和/或羊水成纖維細(xì)胞，篩選或誘導(dǎo)成肺干細(xì)胞。

(2)給干細(xì)胞裝配新冠病毒易感基因：將血管緊張素轉(zhuǎn)換酶II基因連接慢病毒表達(dá)載體pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，將重組質(zhì)粒pHBLV-OE-ACE2和包裝質(zhì)粒(psPAX2和pMD2G)或者將重組質(zhì)粒pGC-FU-ACE2和包裝質(zhì)粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分別共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝攜帶ACE2的重組慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，將重組慢病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，使ACE2基因整合到干細(xì)胞DNA。

(3)給干細(xì)胞裝配新冠病毒RNA干擾基因：優(yōu)選新冠病毒(nCoV)的靶向干擾序列siRNA，合成shRNA模板，連接到慢病毒載體pHBLV或LV3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，將重組質(zhì)粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包裝質(zhì)粒(pHBLV、psPAX2載體和pMD2G載體)或者將重組質(zhì)粒LV3-nCoV-N-shRNA和包裝質(zhì)粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，包裝攜帶shRNA的慢病毒，將慢病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，使shRNA基因整合到干細(xì)胞DNA上，使干細(xì)胞獲得能干擾nCoV在胞內(nèi)復(fù)制的新功能。

(4)制成一種人工裝配新冠病毒易感基因和新冠病毒RNA干擾基因從而兼具干細(xì)胞天然治療功能、新冠病毒易感特性和RNA干擾功能的干細(xì)胞。