[發(fā)明專利]一種絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特異性多肽底物

有效

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• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112552377B
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建明;賈云川
• 申請（專利權(quán)）人: 南京紅云生物科技有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/573
• 代理公司: 天津垠坤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12248
• 代理人: 王忠瑋

本發(fā)明提供本一種絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特異性多肽底物，包括如下從N端到C端的結(jié)構(gòu)排列，所述特異性磷酸化多肽底物氨基酸序列為NH2?YACWWYGTLKRWGAKK?COOH。發(fā)明的多肽底物具有穩(wěn)定和靈敏的特點，進而能夠解決體外藥物篩選檢測體系往往因為缺少合適底物而重復(fù)性差、靈敏度低的問題。本發(fā)明的多肽底物可適用于檢測MAP4Ks激酶抑制劑的多種體外酶學(xué)實驗，包括且不限于ADP?GloTM?Kinase?Assay、基于液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(LC?MS)技術(shù)的激酶分析實驗、酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(Elisa)等等，大大提高了檢測的準(zhǔn)確度和效率，具有很強的實用性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外生物化學(xué)檢測領(lǐng)域，具體為一種絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特異性多肽底物。

背景技術(shù)

絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶(MAP4Ks)是一類絲氨酸或蘇氨酸激酶的家族，包括造血祖細(xì)胞激酶1(HPK1/MAP4K1)，生發(fā)中心激酶(GCK/MAP4K2)，生發(fā)中心激酶樣激酶(GLK/MAP4K3)，HPK/GCK樣激酶(HGK/MAP4K4)，Misshapen-如激酶1(MINK1/MAP4K6)和TRAF2和NCK相互作用激酶(TNIK/MAP4K7)，作為有效的LATS1/2激活激酶。MAP4K的過表達(dá)或缺失影響大腫瘤抑制因子1/2(LATS1/2，Wts同源物)和Yes相關(guān)蛋白(YAP)/轉(zhuǎn)錄共激活因子與PDZ結(jié)合基序(TAZ)的磷酸化和活性。通過作用于LATS依賴性但哺乳動物Ste20樣激酶1/2(MST1/2，Hpo同源物)非依賴性方式，MAP4K通過促進其磷酸化和抑制靶基因表達(dá)來限制YAP/TAZ的活性。MAP4K是通過直接磷酸化和激活LATS1/2激酶而成為Hippo途徑的組分.MAP4K2/4/6和MST1/2都屬于STE20樣激酶家族，并且它們的激酶結(jié)構(gòu)域彼此高度同源。MAP4K4通過LATS起作用以抑制YAP和細(xì)胞增殖。

MAP4Ks可以通過磷酸化或泛素化多個細(xì)胞內(nèi)多個靶蛋白以調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響免疫反應(yīng)。例如MAP4K1(HPK1)分別通過磷酸化或泛素化SLP-76蛋白、BLNK蛋白，以抑制免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞受體與B細(xì)胞受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的不識別。在體外生物化學(xué)研究中，模擬MAP4K蛋白激酶家族的磷酸化過程，并篩選有效抑制劑成為熱門。建立一個穩(wěn)定、靈敏的藥物篩選篩選體系成為藥篩的關(guān)鍵。然而體外藥物篩選檢測體系往往因為缺少合適底物而重復(fù)性差、靈敏度低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的基于上述背景技術(shù)，提供一種可以用于體外生物化學(xué)實驗的被絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶(MAP4Ks)特異性識別并磷酸化的底物。

為達(dá)成上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：一種絲裂原蛋白活化激酶激酶激酶激酶的特異性多肽底物，包括如下從N端到C端的結(jié)構(gòu)排列，所述特異性磷酸化多肽底物氨基酸序列為NH2-YACWWYGTLKRWGAKK-COOH；或者為NH2-YACWWYGSLKRWGAKK-COOH。

進一步的，在本發(fā)明中，所述特異性磷酸化多肽底物氨基酸序列的設(shè)計通過對HPK1激酶的位置掃描肽矩陣數(shù)據(jù)中獲取，獲取前以Y-A-X-X-X-X-X-S/T-X-X-X-X-G-A-K-K序列為基礎(chǔ)，X為可變氨基酸殘基；

對絲氨酸或蘇氨酸為中心的10個氨基酸殘基位點分別選取該位置上評分高的氨基酸殘基，中心位置選擇絲氨酸或蘇氨酸，其他9個位置選擇除絲氨酸、蘇氨酸外評分最高的氨基酸殘基。

進一步的，在本發(fā)明中，所述特異性磷酸化多肽底物氨基酸序列的設(shè)計通過對HPK1激酶的位置掃描肽矩陣數(shù)據(jù)中獲取，獲取前以X1-X2-X3-X4-X5-S/T-X6-X7-X8-X9序列為基礎(chǔ)的氨基酸序列，X為可變氨基酸殘基。

X1位置除半胱氨酸C外，還可以是苯丙氨酸F、色氨酸W；

X2位置除色氨酸W外，還可以是半胱氨酸C、異亮氨酸I、苯丙氨酸F、酪氨酸Y、天冬氨酸N；