[發明專利]一種急性分離哺乳動物海馬細胞的方法

有效

• 申請號: 202011353280.6
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112410299B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 楊陽
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種急性分離哺乳動物海馬細胞的方法，屬于細胞分離領域。本發明的方法包括如下步驟：1)切片：在0～4℃下將海馬剪碎；2)消化：用1～3mg/ml木瓜酶消化15～25min，吸出木瓜酶，用1～3mg/ml膠原酶消化15～25min，消化過程持續通入95％O₂和5％CO₂混合氣體；3)終止：終止消化，洗去酶溶液，移入Neurobasal混合液；4)吹打：玻璃管輕柔吹打，靜置，吸取上層混懸液加入培養皿；5)貼壁：室溫下貼壁30～45min。本發明的方法省時高效，所得細胞質量高，可提高膜片鉗實驗的成功率。

技術領域

本發明屬于細胞分離領域。

背景技術

海馬位于側腦室下角底部，與人類的學習記憶關系密切，并具有特殊的皮層結構，且纖維聯系較明確，因而對海馬的研究一直是神經生理學、神經生物學、生理心理學工作研究的熱點。

膜片鉗技術是研究海馬細胞的重要手段。該技術是用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區域(膜片)與其周圍在電學上分隔，在此基礎上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流(pA級)進行監測記錄的方法。因此，膜片鉗技術對細胞質量要求高，不僅要求細胞具有形態學的完整，細胞膜脆性低，更要求各項生理學功能和離子通道的完整。對于不滿足前述要求的細胞，膜片鉗實驗往往無法成功封接吸破，導致實驗失敗。

急性分離的哺乳動物海馬細胞在功能和結構上接近生理狀態，相對于細胞培養得到的細胞更加適用于開展膜片鉗實驗。但現有的急性分離方法仍然存在不利于膜片鉗實驗展開的問題：1)酶的孵育需要較長時間，不同酶的消化時間、溫度難以確定，嚴重影響細胞質量，例如胰酶會直接損傷NMDA受體通道，鏈蛋白酶、木瓜酶對通道影響小但細胞膜脆性增大，難以形成適用于膜片鉗封接吸破的單細胞；2)細胞成活率低，成活時間短。另外，現有的急性分離方法都在酶孵育前用氧飽和的人工腦脊液孵育50～60min，耗時較長。

發明內容

本發明要解決的問題是：提供一種耗時短、細胞質量高、成活率高的急性分離哺乳動物海馬的方法。

術語“海馬”指大腦中的海馬區，與海洋魚類海馬不同。

本發明的技術方案如下：

一種用于急性分離哺乳動物海馬細胞的酶解方法，該方法包括：

使用木瓜酶和膠原酶先后消化海馬組織碎塊；

木瓜酶、膠原酶的工作濃度為1～3mg/ml，各自消化時長15～25min。

進一步地，所述膠原酶為I型膠原酶。

進一步地，木瓜酶濃度為2mg/ml，木瓜酶消化時間20min；

和/或，膠原酶濃度為2mg/ml，膠原酶消化時間20min。

一種急性分離哺乳動物海馬細胞的方法，包括如下步驟：

1)切片：取海馬組織，在0～4℃下將海馬組織剪碎；

2)消化：用1～3mg/ml木瓜酶消化15～25min，吸出木瓜酶，用1～3mg/ml膠原酶消化15～25min，消化過程持續通入95％O₂和5％CO₂混合氣體；

3)終止：終止消化，洗去酶溶液，移入Neurobasal混合液；

4)吹打：玻璃管輕柔吹打，靜置，吸取上層混懸液加入培養皿；

5)貼壁：室溫下貼壁30～45min。

進一步地，步驟1)的剪碎過程中，海馬位于HBSS或DMEM培養基中。

進一步地，步驟1)中剪碎至1mm²的碎塊。