[發(fā)明專利]一種皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011331103.8
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112375731A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬雋;崔慧先;郭瑞云;馮寶峰;孔德勝;何晶晶;劉鑫;杜曉峰;馬振環(huán);劉博鑫
• 申請（專利權(quán)）人: 河北醫(yī)科大學(xué);河北多能干細(xì)胞生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 昆明合盛知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53210
• 代理人: 龍燕

本發(fā)明公開一種皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明所述方法對皮膚組織經(jīng)過胰蛋白酶預(yù)處理，將處理后的組織劃痕固定在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，分離出皮膚成纖維細(xì)胞。本發(fā)明所述方法可以為在短時間內(nèi)得到大量的成纖維細(xì)胞，提高了效率，節(jié)省了時間和原料，且能保證所得到成纖維細(xì)胞的增殖能力和傳代活性，有利于其在后續(xù)利用中充分發(fā)揮作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

成纖維細(xì)胞是皮膚真皮網(wǎng)織層中最重要的細(xì)胞，主要存在于疏松結(jié)締組織中，能合成和分泌大量膠原蛋白，對維持皮膚的彈性和韌性具有重要作用。從組織中分離出的成纖維細(xì)胞具有很高的增殖潛能，在皮膚燒傷修復(fù)、美容以及再生醫(yī)學(xué)等方面有廣泛的應(yīng)用。并且，由于干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，重編程成纖維細(xì)胞為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞已經(jīng)成為成纖維細(xì)胞的一個重要用。因此快速高效的從皮膚組織中分離出成纖維細(xì)胞已經(jīng)成為干細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域的重要部分。

目前分離皮膚成纖維細(xì)胞的方法主要有兩種-酶消化法和組織塊貼壁法。組織塊貼壁法通過固定真皮組織塊，使真皮成纖維細(xì)胞從微小的組織塊中爬出，但是操作發(fā)現(xiàn)，該方法對于組織塊需求較大，極易造成組織浪費(fèi)；而且由于組織致密，細(xì)胞不易獲得營養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞活力和增殖能力不佳；培養(yǎng)時間長，在培養(yǎng)過程中容易發(fā)生污染。

而酶消化法處理方法所需消化時間從1小時到4℃過夜不等，操作復(fù)雜，所需組織塊較大，并且組織無法長期培養(yǎng)造成浪費(fèi)較多。在處理過程中，酶的長時間消化對細(xì)胞損傷較大，導(dǎo)致細(xì)胞活力和增殖能力較差，純度較低，細(xì)胞分離培養(yǎng)周期長，對于后續(xù)成纖維細(xì)胞的利用造成困難。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：采用現(xiàn)有技術(shù)分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)周期長，細(xì)胞生長緩慢且細(xì)胞活力和增殖能力較低的問題。

本發(fā)明的目的在于提供一種皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，能夠在短時間內(nèi)快速高效的分離出成纖維細(xì)胞，又能夠保證細(xì)胞活力和增殖能力，傳代穩(wěn)定，并且細(xì)胞純度較高，為后續(xù)重編程以及臨床治療提供了穩(wěn)定的種子細(xì)胞；具體為：采用胰蛋白酶對皮膚組織進(jìn)行預(yù)處理，之后將預(yù)處理的組織經(jīng)過劃痕法固定在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，分離成纖維細(xì)胞。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述胰蛋白酶的質(zhì)量百分比濃度為0.25％-0.5％。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述胰蛋白酶預(yù)處理的具體過程為：胰蛋白酶預(yù)處理的具體過程為：皮膚組織棄表皮，將真皮部分置于胰蛋白酶中，37℃條件下消化1-3小時，離心后去上清液。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述預(yù)處理的組織培養(yǎng)過程所用的培養(yǎng)基為：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％NEAA+1％雙抗。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述預(yù)處理組織培養(yǎng)過程的養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為37℃，體積百分比濃度為5％的CO₂，培養(yǎng)時間為4-10天。

本發(fā)明所述所述成纖維細(xì)胞包括但不局限于人與哺乳動物來源的皮膚成纖維細(xì)胞。

本發(fā)明的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法，該方法充分考慮了目前臨床樣本稀缺，尤其一些特殊疾病樣本獲取困難的問題，具有節(jié)約樣本、提高組織利用率的優(yōu)點(diǎn)。

(2)本發(fā)明所述方法通過酶消化降低組織致密程度，提高了細(xì)胞從組織中遷移出的阻力，加快了細(xì)胞從組織中遷移出的時間，提高分離效率。

(3)本發(fā)明所述方法避免了胰蛋白酶長期消化細(xì)碎組織給細(xì)胞帶來的巨大損傷，提高了原代成纖維細(xì)胞的活力和增殖能力，加快了細(xì)胞的生長速度。

(4)通過大量的研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述方法分離培養(yǎng)出的成纖維細(xì)胞純度較高，活性維持較好，可多次穩(wěn)定傳代。