[發(fā)明專利]一種循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒及檢測方法

在審

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• 申請日: 2020-11-20
• 公開（公告）號: CN112462058A
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁顯廷;張瑜
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N21/64
• 代理公司: 上海旭誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括：CTC富集的CD36抗體，2％FBS的HBSS緩沖液，密度梯度離心液，紅細(xì)胞裂解液，細(xì)胞破膜封閉液，熒光標(biāo)記的神經(jīng)元特異性抗體，熒光標(biāo)記的白細(xì)胞經(jīng)典標(biāo)志物抗體，細(xì)胞核熒光染料，微孔陣列芯片，包含循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品和包含陽性對照和陰性對照的質(zhì)控品。

2.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光標(biāo)記的神經(jīng)元特異性抗體為熒光標(biāo)記的神經(jīng)元特異核蛋白抗體，又稱為NeuN熒光標(biāo)記抗體，所述熒光標(biāo)記的白細(xì)胞經(jīng)典標(biāo)志物抗體為APC標(biāo)記小鼠抗人CD45抗體，又稱為CD45-APC抗體，所述細(xì)胞核染色劑為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Hoechst33342，Hoechst33258或Hoechst34580。

3.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述微孔陣列芯片用3％BSA封閉。

4.如權(quán)利要求1所述的循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞破膜封閉液是含有0.3％Triton-100，5％羊血清(NGS)和0.05％吐溫20(Tween-20)的磷酸鹽緩沖液。

5.基于權(quán)利要求2所述的循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒的密度梯度離心試劑盒，其特征在于，所述密度梯度離心試劑盒還包括密度梯度離心管和密度梯度離心液。

6.如權(quán)利要求5所述的密度梯度離心試劑盒的檢測方法，其特征在于，檢測步驟包括：

A1、將5毫升血液樣本與25-125微升CTC富集的CD抗體室溫孵育20分鐘獲得混合液L1；

A2、將15毫升含有2％FBS的HBSS緩沖液加入到混合液L1中充分混勻，得到混合液L2；

A3、將15毫升密度梯度離心液通過密度梯度離心管中間的小孔加入到密度梯度離心管的底部；

A4、混合液L2沿著密度梯度離心管的管壁轉(zhuǎn)移到密度梯度離心管中；

A5、配平后，1200g離心20分鐘，得到離心液L1；

A6、離心后，將上層的離心液L1轉(zhuǎn)移到15毫升離心管中，再次配平后，600g離心8分鐘，得到離心液L2；

A7、離心液L2棄上清后得到離心液L3，離心液L3中加入0.5毫升紅細(xì)胞裂解液，室溫孵育5分鐘；

A8、300g離心5分鐘，得到離心液L4，棄離心液L4的400微升上清后，得到混合液L3，將剩余100微升混合液L3重懸并轉(zhuǎn)移到預(yù)先用3％BSA封閉的可尋址微孔陣列芯片中；

A9、在微孔陣列芯片上對細(xì)胞進(jìn)行固定，破膜打孔封閉處理，4℃過夜孵育NeuN抗體，吸棄NeuN抗體并用PBS充分清洗，加入熒光標(biāo)記二抗，CD45-APC抗體和DAPI充分混勻后加在微孔陣列芯片上并避光孵育2小時，PBS充分清洗；

A10、借助高內(nèi)涵顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡等顯微成像系統(tǒng)對微孔陣列芯片進(jìn)行掃描成像。

7.如權(quán)利要求6所述的密度梯度離心試劑盒的檢測方法，其特征在于，步驟A10中，檢測結(jié)果為NeuN⁺/CD45^-/DAPI⁺的細(xì)胞為循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞。

8.基于權(quán)利要求2所述的循環(huán)神經(jīng)細(xì)胞檢測試劑盒的免疫磁珠試劑盒，其特征在于，所述免疫磁珠試劑盒還包括CD45修飾的免疫磁球。