[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)DNA的免疫層析試紙條及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011308564.3
• 申請(qǐng)日: 2020-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN112522368A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國(guó)東;余慶才;張靜;邱萬(wàn)偉;錢立生;李坤;張學(xué)記
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽科技學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6804
• 分類號(hào): C12Q1/6804
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 瞿曉晶

1.一種用于檢測(cè)DNA的免疫層析試紙條，包括底板和順次連接在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、測(cè)試墊和吸收墊，其特征在于，

所述結(jié)合墊上噴涂有檢測(cè)探針與金納米棒的偶聯(lián)物；所述檢測(cè)探針為5’端巰基修飾的單鏈DNA；所述檢測(cè)探針與待檢測(cè)DNA的核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)；

所述檢測(cè)墊上設(shè)置有檢測(cè)線和質(zhì)控線；所述檢測(cè)線上噴涂有捕獲探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物；所述捕獲探針的3’端經(jīng)生物素標(biāo)記；

所述質(zhì)控線上噴涂有質(zhì)控探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物；所述質(zhì)控探針的3’端經(jīng)生物素修飾；所述質(zhì)控探針與待檢測(cè)DNA的核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述金納米棒的長(zhǎng)度為20～200nm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述檢測(cè)探針與金納米棒的偶聯(lián)物的制備方法包括：

在金納米棒中依次加入dATP、十二烷基硫酸鈉水溶液、氯化鈉水溶液和檢測(cè)探針，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，離心，收集沉淀，洗滌，重懸，得到含有檢測(cè)探針與金納米棒的偶聯(lián)物的溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述金納米棒、dATP、十二烷基硫酸鈉水溶液、氯化鈉水溶液和檢測(cè)探針的體積比為：500：5：7.5：25：85；所述dATP的濃度為1mM；所述十二烷基硫酸鈉水溶液的質(zhì)量濃度為1％；所述氯化鈉水溶液的濃度為2M。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)程序包括：60℃水浴中孵育3h。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述重懸采用的試劑包括洗脫緩沖液；所述洗脫緩沖液包括以下質(zhì)量份的組分：Na₃PO₄·12H₂O 304mg、牛血清蛋白2.0g、蔗糖4.0g、吐溫-200.1g和水40g。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述金納米棒的制備方法包括以下步驟：

1)在十六烷基三甲基溴化銨水溶液中加入HAuCl₄水溶液，在攪拌過(guò)程中加入NaBH₄溶液，繼續(xù)攪拌2min，得到金納米種子溶液；

2)將十六烷基三甲基溴化銨水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、還原劑和所述金納米種子溶液混合，進(jìn)行還原反應(yīng)，得到金納米棒。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述捕獲探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的制備方法包括：將捕獲探針和鏈霉親和素水溶液混合，進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)反應(yīng)液，將所述偶聯(lián)反應(yīng)液和濃度為500mg/L的PBS混合，置于截留分子量為30000的樣品濃縮管中，6000rpm 20min離心以除去未反應(yīng)的捕獲探針，收集上清液，得到含有捕獲探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的捕獲探針溶液；所述捕獲探針和鏈霉親和素水溶液的比例為50nmol：80μL。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的制備方法包括：將質(zhì)控探針和濃度為2.5mg/mL的鏈霉親和素水溶液混合，進(jìn)行偶聯(lián)，得到偶聯(lián)反應(yīng)液，將所述偶聯(lián)反應(yīng)液和濃度為500mg/L的PBS混合，置于截留分子量為30000的樣品濃縮管中，6000rpm、20min離心以除去未反應(yīng)的捕獲探針，收集上清液，得到含有質(zhì)控探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的質(zhì)控探針溶液；所述質(zhì)控探針和鏈霉親和素水溶液中鏈霉親和素的摩爾比為4：1。

10.權(quán)利要求1～9任意一項(xiàng)所述免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

S1.將硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上，依次固定結(jié)合墊、樣品墊和吸收墊；

S2.在所述結(jié)合墊上吸附檢測(cè)探針與金納米棒的偶聯(lián)物，在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線噴涂捕獲探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物，在質(zhì)控線噴涂質(zhì)控探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物，得到免疫層析試紙條；所述捕獲探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的噴涂量為0.5～1μL；所述質(zhì)控探針與鏈霉親和素的偶聯(lián)物的噴涂量為0.5～1μL；所述檢測(cè)探針與金納米棒的偶聯(lián)物的吸附量為8～12cm²。