[發(fā)明專利]一株能夠緩解高木糖利用與高魯棒性拮抗的C6/C5共發(fā)酵釀酒酵母及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011296559.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112375694B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑曉明;趙建志;韋方卿;李洪興;李在祿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 齊魯工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/18
• 分類號(hào): C12N1/18;C12N1/36;C12N15/01;C12P7/10;C12R1/865
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 陳桂玲

本發(fā)明公開(kāi)了一株能夠緩解高木糖利用與高魯棒性拮抗的C6/C5共發(fā)酵釀酒酵母，命名為酵釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)6M?15，已于2020年08月17日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏編號(hào)為CGMCC No.20436。本發(fā)明還公開(kāi)了所述釀酒酵母在以秸稈類木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解液為原料發(fā)酵生產(chǎn)二代燃料乙醇中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的菌株在能夠耐受多重抑制物的同時(shí)，還具備了C6/C5高效共發(fā)酵能力，并且能夠消耗完全部的葡萄糖和木糖生成乙醇，其糖醇轉(zhuǎn)化率為0.43g g^?1。本發(fā)明的菌株和采用的篩選策略為進(jìn)一步選育發(fā)酵性能更優(yōu)的二代燃料乙醇生產(chǎn)的釀酒酵母菌株提供了技術(shù)參考與基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種C6/C5共發(fā)酵釀酒酵母及其應(yīng)用，尤其涉及一株能夠緩解高木糖利用與高魯棒性拮抗的C6/C5共發(fā)酵釀酒酵母菌株及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生能源，年產(chǎn)量超過(guò)10¹³噸。隨著石化資源的日益枯竭和環(huán)境污染問(wèn)題，發(fā)展以木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)為原料的生物基能源技術(shù)是實(shí)現(xiàn)能源轉(zhuǎn)型的重要措施之一，也是世界范圍內(nèi)新能源格局的重要部分。以木質(zhì)纖維類生物質(zhì)為原料，通過(guò)微生物細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)化生產(chǎn)清潔液體燃料和化學(xué)品，是生物基能源技術(shù)的重要路徑。木質(zhì)纖維素因其化學(xué)結(jié)構(gòu)堅(jiān)固致密難以被微生物直接利用，因而需對(duì)原料進(jìn)行必要的水解處理以釋放微生物可直接利用的糖類組分。然而，木質(zhì)纖維素水解液的化學(xué)成分較為復(fù)雜，同時(shí)含有六碳糖、五碳糖等糖類組分，以及弱酸類、呋喃類和酚類等非糖組分抑制物。其中，非糖組分抑制物通常對(duì)發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)和代謝具有抑制作用。因此，依據(jù)木質(zhì)纖維素水解液組分特點(diǎn)，發(fā)酵微生物在性能上必須具備兩個(gè)特點(diǎn)，即高效的六碳糖/五碳糖共發(fā)酵能力和較高的抑制物魯棒性。

二代燃料乙醇是以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)的乙醇，是國(guó)際上公認(rèn)的替代化石能源的理想液體燃料之一。作為乙醇生產(chǎn)的主要發(fā)酵微生物，釀酒酵母因其強(qiáng)大的己糖發(fā)酵能力、魯棒性以及成熟的基因操作技術(shù)，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)燃料乙醇的最具潛力的工業(yè)菌株之一。然而，野生型釀酒酵母由于缺乏戊糖(例如木糖)代謝的關(guān)鍵途徑，只有極其微弱的戊糖代謝能力。木糖是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)中含量第二高的戊糖，其能否高效利用是提高原料底物轉(zhuǎn)化效率和燃料乙醇經(jīng)濟(jì)盈利性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。為了提高釀酒酵母的木糖利用能力，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家開(kāi)展了大量的工作，主要包括：1)木糖代謝起始途徑的異源引入，即木糖還原酶-木糖醇脫氫酶(XR-XDH)途徑和木糖異構(gòu)酶(XI)途徑；2)木糖代謝內(nèi)源途徑代謝優(yōu)化；3)細(xì)胞內(nèi)輔因子代謝平衡優(yōu)化；4)特異性高效木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白篩選；5)適應(yīng)性進(jìn)化工程等。經(jīng)過(guò)研究者們的不懈努力，釀酒酵母的純品木糖代謝能力已基本達(dá)到葡萄糖的代謝水平。雖然釀酒酵母具備了葡萄糖和木糖共利用的能力，但其對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中抑制物的抗性仍然較低，而抑制物魯棒性亦是影響微生物生長(zhǎng)和代謝效率的重要因素。近十年來(lái)，科學(xué)家通過(guò)改造細(xì)胞內(nèi)抑制物抗性響應(yīng)途徑等理性改造策略，以及隨機(jī)突變和適應(yīng)性進(jìn)化等非理性策略，在一定程度上提高了細(xì)胞對(duì)單一抑制物的抗性。然而，對(duì)存在于木質(zhì)纖維素水解液中多種類抑制物的協(xié)同抑制效應(yīng)，即使較低濃度的混合抑制物亦可表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。在研究過(guò)程中，包括申請(qǐng)人團(tuán)隊(duì)在內(nèi)的國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在提高抑制物抗性的同時(shí)，其木糖代謝能力出現(xiàn)了不同程度的下降，似乎這兩種性狀存在此消彼長(zhǎng)的拮抗關(guān)系。因此，在細(xì)胞內(nèi)同時(shí)獲得高木糖代謝和高魯棒性這兩種特性對(duì)選育二代燃料乙醇生產(chǎn)菌株帶來(lái)了不小的挑戰(zhàn)。

申請(qǐng)人在前期工作中，基于牛瘤胃宏基因組中篩選得到高活性木糖異構(gòu)酶和來(lái)自Meyerozyma guilliermondii的特異性木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MGT05196N360F，通過(guò)理性代謝工程及適應(yīng)性進(jìn)化工程構(gòu)建了一株葡萄糖/木糖高效共利用重組釀酒酵母菌株，但其在含較高抑制物濃度的玉米秸稈水解液中魯棒性較差。申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在提高該菌株抑制物魯棒性的研究中，魯棒性提高的同時(shí)，木糖代謝明顯下降，上面提到的拮抗關(guān)系再次出現(xiàn)。經(jīng)檢索，針對(duì)菌株中木糖代謝和魯棒性之間的拮抗性，在釀酒酵母中目前有關(guān)消除或緩解這一拮抗性的專利和相關(guān)文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容