[發明專利]利用3D生物打印技術構建的人工卵巢支架、人工卵巢及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202011293874.2
• 申請日: 2020-11-18
• 公開（公告）號: CN112386743A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 王世宣;張金金;吳桐;高越越
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/24;A61L27/52;B33Y70/10;C12N5/075
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 胡鎮西;舒景景

1.一種利用3D生物打印技術構建的人工卵巢支架，其特征在于：采用混有顆粒細胞的3D打印用生物墨水進行3D打印和固化得到人工卵巢支架，所述顆粒細胞是指哺乳動物卵巢卵泡期的卵母細胞四周圍繞著的菱形或扁平的、細胞漿中含有顆粒的細胞。

2.根據權利要求1所述的人工卵巢支架，其特征在于：每毫升所述3D打印用生物墨水中含有哺乳動物的卵巢顆粒細胞數量為(2～8)×10⁶個。

3.根據權利要求1所述的人工卵巢支架，其特征在于：所述3D打印用生物墨水的配制原料包括顆粒細胞懸液、甲基丙烯酰化水凝膠和藍光引發劑，所述甲基丙烯酰化水凝膠和藍光引發劑的加入量以滿足正常固化所需為準。

4.根據權利要求3所述的人工卵巢支架，其特征在于：所述甲基丙烯酰化水凝膠、顆粒細胞懸液和藍光引發劑的體積比為(2～5)∶(4～7)∶1，其中，甲基丙烯酰化水凝膠的體積按濃度為20％的儲備液計。

5.根據權利要求3所述的人工卵巢支架，其特征在于：所述甲基丙烯酰化水凝膠的接枝率為50％～80％、pH為7.0～7.5，工作濃度為5％～15％。

6.根據權利要求1～5中任一項所述的人工卵巢支架，其特征在于：該人工卵巢支架呈多層柵格狀，每一層具有平行的多條柵條(1)，相鄰層的柵條(1)呈30°～150°夾角。

7.一種如權利要求1～6中任一項所述人工卵巢支架的構建方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

1)獲取哺乳動物的卵巢顆粒細胞并進行培養，得到顆粒細胞懸液；

2)利用步驟1)得到的顆粒細胞懸液制備含有顆粒細胞的3D打印用生物墨水；

3)以步驟2)得到3D打印用生物墨水作為打印材料，采用擠出式3D生物打印機進行打印，并采用合適的固化方式，得到分布有存活顆粒細胞的人工卵巢支架。

8.根據權利要求7所述的人工卵巢支架的構建方法，其特征在于：所述步驟1)中顆粒細胞的培養具體包括如下步驟：將顆粒細胞放入溫度為37℃、CO₂體積分數為5％的細胞培養箱培養3～5天，所述培養箱中的培養基的主體是McCoy’s 5A培養基，同時添加有胎牛血清、雄激素、青霉素和鏈霉素，其中胎牛血清占總體積的10％，青霉素和鏈霉素合計占總體積的0.1％，雄激素在培養基中的濃度為10ng/ml；培養開始后12～24h首次更換培養基，之后每隔一天更換培養基一次；取對數生長期的細胞，采用胰蛋白酶消化后制成顆粒細胞懸液。

9.根據權利要求7所述的人工卵巢支架的構建方法，其特征在于：當該人工卵巢支架用于模擬人的卵巢時，所述步驟1)中顆粒細胞的獲取具體包括如下步驟：將卵泡液離心后，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再加入人外周血淋巴細胞分離液，再次離心，得到卵巢顆粒細胞黏液團，抽取中間層黏液團至培養基中重懸，反復吹打后得到含顆粒細胞的原始懸液。

10.根據權利要求7～9中任一項所述的人工卵巢支架的構建方法，其特征在于：

所述步驟2)的具體步驟為：將甲基丙烯酰化水凝膠、顆粒細胞懸液和藍光引發劑按一定體積比混合均勻，得到3D打印用生物墨水；

和/或：所述步驟3)中，固化方式為低溫固化和光固化；

和/或：所述步驟3)中，打印時采用22～27G口徑的噴嘴，打印溫度為22～25℃，打印平臺溫度10～15℃，光固化時間為10～20s。

11.一種采用如權利要求1～6中任一項所述人工卵巢支架的人工卵巢，其特征在于：該人工卵巢包括所述人工卵巢支架和負載在其上的哺乳動物卵泡。

12.一種如權利要求11所述人工卵巢的構建方法，其特征在于：該方法通過在所述人工卵巢支架上添加哺乳動物卵泡來構建人工卵巢。