[發(fā)明專(zhuān)利]一種Tulp2多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011279339.1
• 申請(qǐng)日: 2020-11-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112553233B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-01-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭英;徐文華;葛婷婷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N1/21;C07K14/47;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/68;A61K39/395;A61P15/08;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷

本發(fā)明公開(kāi)了一種重組表達(dá)載體、重組菌、Tulp2原核蛋白及其制備方法，本發(fā)明還公開(kāi)了一種Tulp2多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了Tulp2原核蛋白、Tulp2蛋白多克隆抗體在制備診斷或治療男性不育癥試劑或藥物中的應(yīng)用。該Tulp2多克隆抗體能特異性識(shí)別小鼠及人組織中的Tulp2蛋白，可應(yīng)用于小鼠及人多種組織ELISA、Western Blot、組織免疫熒光等技術(shù)分析，具有特異性高，適用廣泛等特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Tulp2多克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

Tulp（tubby-like protein，Tulp）家族是在漸進(jìn)性肥胖Tubby突變小鼠中首先發(fā)現(xiàn)的蛋白，Tubby常染色體隱形遺傳突變小鼠患有肥胖、聽(tīng)力缺失、視網(wǎng)膜變性、雄性不育、胰島素抵抗等多種疾病，提示Tulp 家族成員具有多種功能。Tulp2是Tulp家族成員之一，Tulp2羧基端含有與其他成員相似的tubby結(jié)構(gòu)域，氨基端具有IFT-A結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其基因敲除雄性小鼠不育，提示其在小鼠睪丸組織中發(fā)揮重要的作用。

為探索Tulp2的功能，需對(duì)其進(jìn)行功能分析及作用機(jī)制研究。經(jīng)檢索，目前未發(fā)現(xiàn)有商品化的抗小鼠Tulp2抗體出售，同時(shí)，經(jīng)文獻(xiàn)檢索，也未發(fā)現(xiàn)抗小鼠Tulp2的多克隆及單克隆抗體的任何文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明應(yīng)用大腸桿菌原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Tulp2原核蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，所獲得的原核蛋白比預(yù)計(jì)蛋白分子量大，同時(shí)，在真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)中獲得的Tulp2真核蛋白也有類(lèi)似的結(jié)果。因此，應(yīng)用Tulp2的哪一種抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，進(jìn)而獲得特異性識(shí)別小鼠內(nèi)源性Tulp2蛋白是本發(fā)明的決定性因素。為研究Tulp2的功能，闡明其在正常生理情況下的作用機(jī)制，研究其在精子發(fā)生過(guò)程中的具體作用，本發(fā)明首先應(yīng)用大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了小鼠Tulp2全長(zhǎng)原核蛋白的表達(dá)和純化，然后應(yīng)用純化的原核蛋白免疫新西蘭大白兔，從而獲得抗小鼠Tulp2多克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用制備的Tulp2多克隆抗體，對(duì)小鼠血液進(jìn)行ELISA分析，對(duì)小鼠睪丸組織進(jìn)行免疫熒光分析及Western Blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該抗體能夠特異性識(shí)別小鼠睪丸組織中的Tulp2蛋白。本發(fā)明為研究Tulp2的功能提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也有可能為臨床男性不育癥的診斷和治療提供新的靶標(biāo)。

技術(shù)方案：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)質(zhì)粒是將Tulp2基因插入到原核表達(dá)載體中得到重組表達(dá)載體。

其中，所述原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體，具體的，所述大腸桿菌表達(dá)載體為pET-30a（+）。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種重組菌，所述重組菌是將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，篩選得到重組菌。

其中，所述的宿主菌為大腸桿菌JM109或E.coli BL21。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種Tulp2原核蛋白，所述Tulp2原核蛋白是將所述的重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后獲得。

其中，本發(fā)明所述的Tulp2原核蛋白分子量約90KD。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種Tulp2原核蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1）、Tulp2基因的獲得；

2）、Tulp2原核表達(dá)載體構(gòu)建：將Tulp2基因插入到原核表達(dá)載體中獲得；

3）、重組菌的獲得：將步驟2）得到的原核表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中即得重組菌；

4）、Tulp2原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)即可得到Tulp2原核蛋白；

5）、Tulp2原核蛋白的純化。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種Tulp2蛋白多克隆抗體，將所述的Tulp2原核蛋白免疫動(dòng)物即得，所述動(dòng)物包括但不僅限于新西蘭大白兔。