[發(fā)明專利]一種快速熒光蛋白酶活性檢測方法

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• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN112326620A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫永剛
• 申請（專利權(quán)）人: 南京思泰樂生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種快速熒光蛋白酶活性檢測方法，預(yù)先設(shè)定一份蛋白酶含量值參考表；S2、配置熒光用探針的熒光溶液；S3、根據(jù)預(yù)先設(shè)定的蛋白酶含量值參考表對應(yīng)不同顏色的熒光溶液；創(chuàng)建蛋白酶熒光色參考表；S4、測定樣品中是否有蛋白酶；S5、然后將樣品中含有蛋白酶的樣品放入到S2的熒光溶液中，進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為20?37℃條件下,培養(yǎng)1.5?2小時(shí)；S6、用戶在35?37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測，獲得顯示不同的熒光顏色，然后在蛋白酶熒光色參考表中查找對應(yīng)的蛋白酶含量值。本發(fā)明整個(gè)操作工藝簡單，能夠增加快速的發(fā)現(xiàn)檢測樣品中是否有蛋白酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蛋白酶標(biāo)記的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種快速熒光蛋白酶活性檢測方法。

背景技術(shù)

蛋白酶是最重要的一種工業(yè)酶制劑，能催化蛋白質(zhì)和多肽水解，廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。在干酪生產(chǎn)、肉類嫩化和植物蛋白改性中都大量的使用蛋白酶。此外，胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶都是人體消化道中的蛋白酶，在它們的作用下，人體攝入的蛋白質(zhì)被水解成小分子肽和氨基酸。

蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在 pH 為8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。

目前在焙烤工業(yè)中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、細(xì)菌蛋白酶和植物蛋白酶。面包生產(chǎn)中應(yīng)用蛋白酶能改變面筋性能，其作用形式和面包調(diào)制時(shí)力的作用及還原劑的化學(xué)反應(yīng)不同。蛋白酶的作用不是破壞二硫鍵，而是斷開形成面筋的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。蛋白酶在面包生產(chǎn)中的作用主要表現(xiàn)在面團(tuán)發(fā)酵過程中。由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白質(zhì)降解為肽、氨基酸，以供給酵母碳源，促進(jìn)發(fā)酵，因此說明蛋白酶很重要，而蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)，目前一般通過無影管檢測蛋白酶，整個(gè)檢測工藝復(fù)雜，而且后期查看也不太方便，故此需要改進(jìn)，如何利用熒光標(biāo)記的方式來檢測蛋白酶位置顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速熒光蛋白酶活性檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的檢測工藝復(fù)雜的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種快速熒光蛋白酶活性檢測方法，包括以下步驟：

S1、預(yù)先設(shè)定一份蛋白酶含量值參考表；

S2、配置熒光用探針的熒光溶液：以市售純度高于98%的芘、尼羅紅、 香豆素481、 蘇丹紅、 氟硼熒染料為熒光探針，將疏水性染料溶解到市售光譜純丙酮、 氯仿或甲醇的有機(jī)溶劑中并添加具有不同溫度下和200-500nm不同紫外光激發(fā)下呈現(xiàn)不同發(fā)光顏色的熒光材料， 配制熒光溶液；

S3、根據(jù)預(yù)先設(shè)定的蛋白酶含量值參考表對應(yīng)不同顏色的熒光溶液；創(chuàng)建蛋白酶熒光色參考表；

S4、測定樣品中是否有蛋白酶；

S5、然后將樣品中含有蛋白酶的樣品放入到S2的熒光溶液中，進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為20-37℃條件下,培養(yǎng)1.5-2小時(shí)；

S6、用戶在35-37°C下進(jìn)行熒光光譜跟蹤檢測，獲得顯示不同的熒光顏色，然后在蛋白酶熒光色參考表中查找對應(yīng)的蛋白酶含量值。

進(jìn)一步，還包括在標(biāo)記蛋白酶時(shí)還需要預(yù)先創(chuàng)建不同溫度下，對應(yīng)熒光材料的顏色變化，然后根據(jù)樣品的實(shí)時(shí)溫度，查詢對應(yīng)標(biāo)記熒光的顏色值。