[發明專利]一種甲狀腺多基因聯合檢測試劑盒

有效

• 申請號: 202011273237.9
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112280864B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 孫石磊;姬云
• 申請（專利權）人: 蘇州科貝生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 尉月麗

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種甲狀腺多基因聯合檢測試劑盒。本發明試劑盒包含：DNA文庫構建的專用接頭；檢測融合基因和點突變的特異性復合引物；文庫擴增復合引物。本發明試劑盒通過對送檢樣品的DNA和RNA共同提取，對RNA進行逆轉錄成cDNA后，與DNA一起進行高通量測序文庫構建，并進行高通量測序，能一次性檢測包括CCDC6?RET/NCOA4?RET融合以及PAX8/PPARγ融合，BRAF(V600E)、HRAS(61)、NRAS(61)、KRAS(12,13)、KRAS(61)、TERTp等多種點突變，操作精簡，用時短，靈敏度可達到0.1%。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種甲狀腺多基因聯合檢測試劑盒。

背景技術

甲狀腺結節是人群中普遍存在的一種甲狀腺疾病，是甲狀腺細胞在局部異常生長所引發的病變。大多數情況下，甲狀腺結節是良性的，可以采取保守治療的方式，但也有5%-10%的甲狀腺結節是惡性的，即甲狀腺癌，需要早期手術治療，才能獲得良好的預后效果。目前，通過細針穿刺（FNA）的方法獲取甲狀腺細胞，進行細胞學檢查是當今評估甲狀腺結節是否為惡性腫瘤的金標準。然而，仍有20%-30%的甲狀腺結節無法通過這種方式獲得明確診斷。

隨著分子生物學技術的進展，分子診斷在甲狀腺結節良惡性的鑒別診斷中，逐漸受到人們的關注。美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）2019年版的臨床實踐指南中明確指出：（1）對細針穿刺無法確定的疑似濾泡型及Hurthle細胞癌（診斷依據為血管或包膜的浸潤），分子檢測有助于判定其良惡性；（2）細胞學無法明確診斷的結節，利用分子診斷的技術，檢測BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ等癌基因的變異對輔助診斷甲狀腺癌具有重要作用。

目前的研究表明基因融合是甲狀腺癌發病的決定性因素之一，癌癥基因組計劃（The Cancer Genome Atlas）繪制的甲狀腺癌的遺傳圖譜提示，基因融合占據了甲狀腺癌基因突變的20%左右。因此鑒定出甲狀腺癌組織中的基因融合及相關基因突變情況對于甲狀腺癌的精準診斷和治療有重要意義。

目前基因融合的檢測，主要依賴于實時熒光定量PCR（Real Time PCR，RT-PCR）、熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）等。FISH和IHC均采用探針雜交原理對已知的基因融合進行檢測，一般一次僅檢測一種類型的基因融合，操作流程復雜，成本較高；RT-PCR具有相對較高的檢測通量，但需要的樣品量較多，實驗操作步驟多，檢測費用較高。對于標志性突變位點通常采用特異性引物進行PCR檢測。但沒有發現對于甲狀腺結節能夠實現一個試劑盒的一管反應同時檢出基因融合突變和點突變。

中國專利CN111349694A公開了一種甲狀腺癌相關基因融合突變的檢測方法及試劑盒，雖然能檢測RET/PTC1融合、RET/PTC3融合及PAX8-PPARG重排這三種甲狀腺癌相關基因融合突變情況，但不能檢測BRAF、KRAS、NRAS、HRAS、TERTp等點突變。

又如中國專利CN110241215B公開了一種用于檢測甲狀腺結節良惡性相關基因變異的引物及試劑盒，可以同時檢測6個基因的15個位點的變異以及3個融合基因變異，其中包括BRAF基因、KRAS基因、HRAS基因、NRAS基因、TERT基因、EIF1AX基因和RET/PTC1融合、RET/PTC3融合、PAX8/PPARγ融合，但該技術方案存在以下缺點：對于融合基因伴侶基因檢測范圍較小，只能檢測PTC1/RET和PTC3/RET兩種融合類型；構建的DNA測序文庫復雜度低，易產生假陽性；操作復雜，需要獨立進行RNA和DNA兩份文庫構建。