[發明專利]一種煙酰胺單核苷酸的制備方法

有效

• 申請號: 202011267324.3
• 申請日: 2020-11-13
• 公開（公告）號: CN112359082B
• 公開（公告）日: 2023-02-21
• 發明（設計）人: 陳可泉;周彩蓮;王昕;許晟
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P19/30
• 分類號: C12P19/30
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

1.一種煙酰胺單核苷酸的制備方法，其特征在于，為以下方式中的任意一種：

方式一：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl緩沖液加入濃度為10 mM 尿苷、10 mM 煙酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl₂，攪拌均勻調至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，粗酶液按初始濃度計算加入的體積，體系中添加ATP再生酶Ppk、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸鈉，37℃條件下反應4 h；

方式二：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl緩沖液加入濃度為10 mM 尿苷、10 mM 煙酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl₂，攪拌均勻調至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，三種粗酶液按初始濃度計算加入的體積，體系中添加ATP再生酶Ppk、Pap、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸鈉，37℃條件下反應4 h；

其中，所述的粗酶液的制備方法包括如下步驟：

（1）分別復制嘌呤核苷磷酸化酶基因、嘧啶核苷磷酸化酶基因和煙酰胺核糖激酶基因，并分別構建于表達載體pET28a中，再轉化大腸桿菌Trans1-T1，得到重組質粒；再分別將重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）中，分別得到重組菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重組菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重組菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr；

（2）將步驟（1）得到的三種重組菌的菌液均接種于LB/KanR液體培養基中，培養至OD₆₀₀為0.5~0.7，加入IPTG，培養，離心，收集菌體；其中，所述的LB/KanR液體培養基中各組分的濃度為：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L，溶劑為水；

（3）將步驟（2）得到的菌體重懸于pH6.0- 8.0 的緩沖液中，破碎，離心，所得上清液即為粗酶液。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，加入IPTG 至終濃度0.025mM~1 mM。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）中，所述的培養為在15~37℃、100-200 rpm條件下振蕩培養12~24 h。