[發明專利]一種原代肝實質細胞的分離提取方法及其應用

有效

• 申請號: 202011263154.1
• 申請日: 2020-11-12
• 公開（公告）號: CN112251398B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 羅海玲;簡路洋;薛瑛
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 孫怡

本發明涉及細胞分離技術領域，具體公開了一種原代肝實質細胞的分離提取方法及其應用。本發明的方法為將灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝組織塊中，以消化分離肝實質細胞獲得細胞懸液，之后，將所述細胞懸液經過濾后獲得的濾液依次進行5次常溫離心，離心條件依次為1000?1580rpm/min×3?5min、500?650rpm/min×3?5min、200?300rpm/min×4min、200?300rpm/min×4min、200?300rpm/min×4min。本發明操作簡單，耗時少，無需低溫離心設備，能高效去除紅細胞和細胞碎片，獲得的肝實質細胞存活率和純度較高。

技術領域

本發明涉及細胞分離技術領域，具體地說，涉及一種原代肝實質細胞的分離提取方法及其應用。

背景技術

早期肝實質細胞的分離一般通過機械剪切及強力吹打等物理手段來分離，但該方法細胞得率極低，活性差。后來有研究者在物理剪碎肝組織后，加入胰蛋白酶和膠原酶對組織碎塊進行消化，提升了肝實質細胞的得率，但細胞存活率和活性仍然不高。隨后，離體膠原酶灌注法被發明出來，該方法是將動物肝臟取出，于門靜脈內置管或直接在獲得的肝組織塊的血管或切口內置管，用預熱的無鈣無鎂的D-Hank's液灌流，然后換用膠原酶作持續灌流，使肝實質細胞與間質分離，經過濾、離心、棄上清后得到肝細胞懸液。離體膠原酶灌注法分離所得肝實質細胞的數量和存活率都有顯著提高。隨后Seglen等研究者在此基礎上創立了改良的Seglen兩步灌流法，該方法獲得肝實質細胞數量和活性較高，廣泛應用于大鼠、小鼠、犬和兔等動物。

但Seglen兩步灌流法要求肝組織盡量完整或者體積較小、血管明顯，且對操作者的技能水平要求較高，還需要蠕動泵、低溫高速離心機等設備。在有些動物(例如，綿羊)飼養實驗后所獲得的肝組織較難滿足兩步灌注法的要求。此外，有些動物肝組織體積龐大，若完全照搬兩步膠原酶灌注法，則需要極其大量的膠原酶和更長的消化時間才能消化完全，往往會降低細胞得率，且由于肝實質細胞存在體外培養條件下無法長期存活，通常實驗中并不需要如此巨量的肝實質細胞。因此，急需建立一種可適用于小塊肝組織分離肝實質細胞的研究方法。

發明內容

針對現有技術的問題，本發明的目的是提供一種操作時間短、設備簡單，尤其適用于從小塊不規則、血管不明顯的肝組織中獲得高質、高量肝實質細胞的方法。

為了實現該目的，本發明的技術方案如下：

一種原代肝實質細胞的分離提取方法，將灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝組織塊中，以消化分離肝實質細胞獲得細胞懸液，之后，將所述細胞懸液經過濾后獲得的濾液依次進行5次常溫離心，離心條件依次為1000-1580rpm/min×3-5min、500-650rpm/min×3-5min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min、200-300rpm/min×4min。

優選離心條件依次為：1200rpm/min×4min、570rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min、240rpm/min×4min。