[發明專利]一種快速檢測格特隱球菌的方法

在審

• 申請號: 202011254539.1
• 申請日: 2020-11-11
• 公開（公告）號: CN112359125A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 薛新穎;劉玉霞;趙晟;臧學磊
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京成實知識產權代理有限公司 11724
• 代理人: 陳永虔

本發明屬于真菌病原學檢測技術領域，公開了一種快速檢測格特隱球菌的方法，其包括如下步驟：步驟1）選擇待測樣本；步驟2）提取格特隱球菌DNA；步驟3）制備實時熒光PCR反應體系；步驟4）熒光PCR擴增。本發明能夠快速準確地檢測出格特隱球菌，靈敏度和特異性較高。

技術領域

本發明屬于真菌病原學檢測技術領域，具體涉及一種準確檢測格特隱球菌的方法。

背景技術

隱球菌是一種病菌，可導致隱球菌病。媒介一般為干的鴿子糞，鮮有人與人之間傳播的報告。尚無特效藥，一般進行對癥處理。隱球菌病是由隱球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和腦膜炎，也引起皮膚、骨骼或內臟器官感染。臨床上結合臨床表現以及顯微鏡檢查結果進行診斷，再通過真菌培養或組織染色加以確認。臨床上治療藥物包括兩性霉素B、三唑類抗真菌藥物和氟胞嘧啶^。

隱球菌屬目前確定的總類一共有37種，其中新生隱球菌和格特隱球菌致病力較強。此前，隱球菌病多為新生隱球菌所致，鮮有格特隱球菌致病的報道。近10年來，關于格特隱球菌病的報道逐漸增多。格特隱球菌之前被認為是新生隱球菌的格特變種(血清型B和C)，直到2002年被確立為一個獨立的物種。和新生隱球菌以及其他真菌病原體一樣，格特隱球菌可以從土壤以及腐爛的有機材料中分離得到，通過擔孢子或隱球菌酵母細胞的吸入感染宿主引起肺炎，經過2-11個月的潛伏期后可以播散和演變為腦膜炎，未經治療的免疫功能不全的患者潛伏期可能更長。新生隱球菌僅以所有感染免疫缺陷宿主為感染對象，而格特隱球菌以熱帶和亞熱帶地區的免疫功缺陷宿主為感染對象，除此之外，其臨床表現、治療藥物以及預后均有所不同。

隱球菌病的診斷通常依靠直接鏡檢、細菌培養臨床樣本或檢測體液中的隱球菌抗原。臨床標本常規染色可以發現隱球菌，印度墨汁染色可以識別痰或腦脊液中的隱球菌但敏感性低。采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)或乳膠凝技術檢測血液中的隱球菌比直接鏡檢更為敏感。國內已建立了ABC-ELISA法、免疫放射測定法用于檢測新生隱球菌抗原，而且特異性和敏感性較高。然而，這些臨床微生物實驗室難以明確菌種，培養是目前較為常用的可靠的區分格特隱球菌和新生隱球菌的方法。最簡單的確定格特隱球菌的方法是把隱球菌分離到刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚藍培養基中培養：格特隱球菌在培養基上生長并使菌落周圍的培養基成為藍色。

通過培養進行區分格特隱球菌和新生隱球菌的方法工作效率較低，耗費時間長，而且人力物力消耗很大，存在較大的局限性。核酸檢測快速便捷，是近年來檢測病原體的發展趨勢。文獻“新生隱球菌格魯比變種、新生變種和格特隱球菌的多重聚合酶鏈反應鑒定，馮曉博 《中華皮膚科雜志》 2012年” 建立了一種基于核糖體基因內間隔區（IGS）的多重聚合酶鏈反應（PCR），用于快速鑒定新生隱球菌新生變種、格魯比變種和格特隱球菌，該方法需要針對每一種菌設計引物，方法比較繁瑣，反應不夠快捷；專利“CN2017101725670”公開了一種檢測并鑒定隱球菌的靶基因、引物和探針及試劑盒，屬于醫學真菌學的領域。根據隱球菌的靶基因，設計該檢測隱球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3與SEQ ID No.4和/或SEQID No.6與SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3與SEQ ID No.4對應于新生隱球菌，SEQ IDNo.6與SEQ ID No.7對應于格特隱球菌，可以在同一體系中用于特異性檢測新生隱球菌與格特隱球菌兩種隱球菌”，該方法只是將特異性擴增新生隱球菌和格特隱球菌引物和檢測探針進行組合，創新性相對較低，而且兩套擴增引物，成本更高，擴增反應相對繁瑣。

因此，需要新的技術和方法來正確檢測并鑒定格特隱球菌。

發明內容

本發明為了克服傳統檢測格特隱球菌的操作繁瑣、靈敏度低、錯誤率高等缺陷，提供一種準確檢測格特隱球菌的方法，該方法可以是診斷目的，也可以是非診斷目的。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案。

一種快速檢測格特隱球菌的方法，其包括如下步驟