[發明專利]一種同時檢測靈芝菌絲體中八種靈芝酸的方法

有效

• 申請號: 202011236822.1
• 申請日: 2020-11-06
• 公開（公告）號: CN112345681B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 馮娜;周帥;張勁松;岳亞文;唐慶九;馮杰;王金艷
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

本發明提供了一種同時檢測靈芝菌絲體中八種靈芝酸的方法，該方法包括如下步驟：(1)靈芝菌絲體的預處理步驟；(2)超高效液相色譜檢測步驟；(3)化合物質譜信息獲得步驟；(4)超高效液相色譜?三重四級桿質譜聯用分析方法建立步驟；(5)數據分析步驟。本發明的同時檢測靈芝菌絲體中八種靈芝酸的方法，可以對靈芝發酵菌絲體中特定的八個靈芝酸化合物同時進行準確的定性定量分析，準確性高，靈敏度高，且專屬性強，適用于靈芝菌絲體中靈芝酸類化合物的檢測分析，從而為靈芝菌絲體的相關研究和產品提供精確可靠的檢測分析方法。

技術領域

本發明涉及藥用菌有效成分檢測分析領域，具體的說涉及一種同時檢測靈芝菌絲體中八種靈芝酸的方法。

背景技術

靈芝(Ganoderma sp.)是我國一種傳統的藥用真菌，根據現代藥理研究，靈芝被認為具有抗腫瘤、抗病毒、防治心血管疾病、保護肝臟、抗氧化、免疫調節等諸多生物活性。目前，對靈芝的研究不僅集中在其子實體上，關于靈芝菌絲體的研究也有多項報道。學者已經從靈芝的發酵菌絲體中分離出來六十多種化合物，主要是靈芝酸、靈芝醇、甾醇等類型。由于處于生長發育的不同階段，菌絲體中的這些化合物與子實體中相比，不僅化學結構不同，其生物活性也有一定差異。

目前，對靈芝菌絲體生物活性的研究多集中在其靈芝酸類化合物上。研究發現，菌絲體中的靈芝酸T(Ganoderic acid T)具有較強的體外抑制多種腫瘤細胞增殖的能力，進一步研究證實，靈芝酸T可以誘導腫瘤細胞發生晚期凋亡和壞死，通過防止細胞-細胞外基質相互作用和增強細胞-細胞聚集來抑制HCT-116腫瘤細胞的轉移，此外，靈芝酸T還可以通過改變線粒體膜電位使得致凋亡活性物質如細胞色素C等的釋放，或者誘導HeLa腫瘤細胞內的活性氧水平升高，從而達到抑制腫瘤細胞的目的。靈芝酸MK(Ganoderic acid Mk)和靈芝酸S(Ganoderic acid S)均能通過線粒體介導的途徑誘導人HeLa細胞凋亡，但具有不同的細胞周期阻滯特異性。靈芝酸Me(Ganoderic acid Me)可通過抑制MDR1、MRPs的表達水平和調節凋亡相關通路，有效逆轉MDR結腸癌細胞的多藥耐藥。另一項研究表明，靈芝酸Me還能增強小鼠lewis肺癌細胞中吲哚胺2，3-雙加氧酶的表達和激活，導致T細胞凋亡和Treg細胞比例增加。

靈芝菌絲體中靈芝酸化合物不同于子實體中化合物，若要得到菌絲體靈芝酸化合物，首先需要發酵設備和相關技術，獲得一定生物量的菌絲體，然后才能從中分離得到靈芝酸化合物，因此存在一定的難度。靈芝酸是靈芝菌絲體中主要的活性物質，因此，學者們多以靈芝酸為考察對象，用分光光度法或高效液相-紫外檢測法對其進行定量。而市場上關于靈芝菌絲體為原料來源的保健品和藥品，也大多以分光光度法檢測三萜含量作為產品指標。事實上，無論是分光光度法，還是高效液相-紫外檢測法，都存在缺陷。這是因為，靈芝菌絲體中不只有靈芝酸這類三萜化合物，還有麥角甾醇、啤酒甾醇等多種甾醇，和亞油酸、棕櫚酸等不飽和脂肪酸，采用分光光度法分析時，這些物質均能和香草醛-冰醋酸和高氯酸等顯色劑發生反應，影響測定的結果。而高效液相-紫外檢測法也存在一定缺陷，因為該方法只能通過保留時間對靈芝酸化合物進行定性，由于菌絲體中很多靈芝酸結構近似導致其極性相近，僅靠保留時間無法將相似的靈芝酸區分開來。

因此，對于靈芝菌絲體中靈芝酸的檢測，需要開發一種精確的定性定量分析方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同時檢測靈芝菌絲體中八種靈芝酸的方法，該方法包括如下步驟：

(1)靈芝菌絲體的預處理步驟：將靈芝菌絲體加入有機溶劑進行超聲提取，取上清液，過濾，得到的濾液稀釋后即為待測樣品溶液；配制八個靈芝酸的混合標準品溶液；

(2)超高效液相色譜檢測步驟：對待測樣品溶液和八個靈芝酸混合標準品溶液進行超高效液相色譜分離，以獲得較好的分離度；

(3)化合物質譜信息獲得步驟：利用質譜優化軟件(Agilent Optimizer)，對八個靈芝酸化合物進行母離子掃描、子離子對的檢出以及最佳碰撞能的尋找；