[發明專利]一種通過灌流培養工藝制備腺病毒載體疫苗的方法

有效

• 申請號: 202011235524.0
• 申請日: 2020-11-09
• 公開（公告）號: CN112094814B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 肖猛;劉云杰;朱濤;許允立;徐燦;李軍強;巢守柏
• 申請（專利權）人: 康希諾生物股份公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;A61K39/00;A61K48/00
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 王立紅;張丹

本發明公開了一種通過灌流培養工藝制備腺病毒載體疫苗的方法。其中，該方法包括腺病毒宿主細胞的培養步驟，特別是根據細胞密度調節灌流速率（例如至少通過兩個階段調節灌流速率）的步驟。該方法在實現腺病毒宿主細胞高密度生長的同時，提高了感染后的病毒的單細胞產量，以及病毒收獲液的比活。

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種腺病毒宿主細胞的培養方法、腺病毒的生產方法以及腺病毒載體疫苗的制備方法，特別是通過灌流培養工藝制備腺病毒載體疫苗的方法。

背景技術

腺病毒是一種無包膜DNA病毒，具有易感染、宿主范圍廣、毒性低、使用安全、容納量大、非整合性、對人致病性小且不誘導癌變等特點，使得腺病毒載體成為基因轉移中最有前途的基因載體之一。

改造后的腺病毒去除了E1/E3基因表達盒，阻止了依賴E1區和E3區功能蛋白的轉錄與隨后病毒DNA的復制及病毒外殼蛋白的產生，E1/E3缺失的腺病毒在能夠提供E1/E3區基因蛋白的細胞中得到增值。

腺病毒具有宿主范圍廣、高轉基因表達能力的特點，目前有高達300種人用治療或者預防性重組腺病毒藥物正用于臨床試驗，廣泛應用的腺病毒載體是人血清型腺病毒Ad5、Ad26型和黑猩猩3、68型腺病毒；以腺病毒作為載體的疫苗也有多個處于臨床研究中。

重組腺病毒載體疫苗是以腺病毒作為載體，將保護性抗原基因重組到腺病毒基因組中，腺病毒感染細胞后，可以將腺病毒基因組連同保護性抗原基因一起注入宿主細胞，從而在細胞內表達保護性抗原，產生體液和細胞免疫。目前有多個腺病毒載體疫苗處于臨床前或者臨床中，如人體免疫缺陷病毒（HIV）、狂犬病毒（RV）、乙肝病毒（HBV）、病肝病毒（HCV）、登革熱病毒（DEN）、皰疹病毒（EB）埃博拉病以及新型冠狀病毒。

293細胞是最常用的腺病毒載體包裝和生產用宿主細胞。293細胞是人腎上皮細胞系，有多種衍生株，比如HEK293，293T/17等；293細胞一般為貼壁生長，但是也有適應懸浮培養的細胞系。HEK293細胞含有腺病毒的E1/E3區，因此，可以用于復制缺陷型腺病毒載體的生產。

現有技術中，293細胞生產腺病毒受限于細胞密度低和細胞產毒少導致產量少，細胞密度低的主要原因是細胞培養受營養供給、氧氣、代謝影響很難對293細胞進行高密度培養。受感染細胞與正常細胞生長、營養物質的競爭，以及受染細胞的狀態等導致產毒不高。雖然定期補加新鮮培養基，用于維持營養環境，可以提高細胞的生長，但是這種生長有限。

發明內容

為克服現有技術的不足，本發明提供一種腺病毒宿主細胞的培養方法，其包括灌流培養的步驟，特別是根據細胞密度調節灌流速率（例如至少通過兩個階段調節灌流速率）的步驟。

具體地，上述方法包括如下步驟：

（1）接種宿主細胞，進行細胞培養；

（2）細胞密度達到1~5×10⁶個/mL（具體如1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶個/mL）后開啟灌流，灌流速率為1-3VVD（容器體積/天）（例如1、1.5、2、2.5、3VVD）；

（3）細胞密度生長至5~10×10⁶個/mL（具體如5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、10×10⁶個/mL）后，調節灌流速率至2-4VVD（例如2、2.5、3、3.5、4VVD）。

具體地，上述細胞培養在生物反應器（例如一次性攪拌式反應器或激流式反應器）中進行。