[發明專利]一種高產核酸的工業釀酒酵母及其應用

有效

• 申請號: 202011224301.4
• 申請日: 2020-11-05
• 公開（公告）號: CN112175850B
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 郭學武;周欣然;趙賓;盧東霞;陳葉福;張翠英;肖冬光
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/31;C12N15/53;C12P19/34;C12R1/865
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一種在過表達YHR094C的基礎上敲除YOR185C和YGR088W基因的高產核酸釀酒酵母工業菌及其構建方法與應用。本發明選育得到的釀酒酵母BY9、BY95、BY958核酸含量(胞內核酸含量與菌體干重的比值)分別為17.53％﹑18.24％﹑18.94％，親本菌株BY23核酸含量為16.22％，相比于親本菌株核酸含量分別提高了8.08％﹑12.45％﹑16.76％，提高了酵母核酸含量。

技術領域:

本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一種在過表達YHR094C 的基礎上敲除YOR185C和YGR088W基因的高產核酸釀酒酵母工業菌及其構建方法與應用。

背景技術:

核糖核酸(簡稱核酸，RNA)是一類重要的生物大分子，首先，對于生物體來說，核糖核酸在基因表達、蛋白質生物合成以及其它生理功能中都起著重要的作用。其次，對于人類社會來說在食品醫藥工業等方面對于核糖核酸的降解產物也有著大量的需求。在食品工業方面，由酵母提取核酸后，采用分解法和直接發酵法等制備的核苷酸被廣泛用于味精、醬油等調味品中。在醫藥工業方面，核糖核酸的降解產物及其衍生物在抗病毒、抗腫瘤和治療心臟病的藥物中有著廣泛的應用。相比于廣泛的需求量，核酸含量還遠遠不夠滿足市場需求。之前多利用經過誘變篩選后的假絲酵母進行核糖核酸的生產，但是假絲酵母至今為止還不能完全確定是對人畜健康無害的，而釀酒酵母早在幾個世紀前就已經被用于面包﹑酒精和啤酒的生產，是公認的GRAS菌株。另外，誘變育種具有隨機性和不穩定性，相比于誘變育種采用分子生物學育種顯得更具有目的性和針對性。

YHR094C編碼葡萄糖轉運蛋白，當葡萄糖濃度大于等于1％時，過表達YHR094C基因葡萄糖利用率得到提高。YOR185C基因編碼GSP2蛋白，GSP2及其同源物GSP1參與了GTP 的結合與代謝，但GSP2對于細胞存活和代謝不起關鍵作用。YGR088W編碼過氧化氫酶Ctt1。

發明內容：

本發明的目的是解決產核酸酵母菌種性能差，核酸含量低等問題，提供一種高產核酸的工業釀酒酵母。

為解決上述技術問題，本發明技術方案如下：

以釀酒酵母為出發菌株，通過在釀酒酵母出發菌株中過表達YHR094C基因，敲除YOR185C和YGR088W基因從而構建了高產核酸的工業釀酒酵母菌株；

優選地，所述釀酒酵母出發菌株可以是BY4741，INVSc1，CICC 32253或CICC 1450等；

更優選地，所述釀酒酵母為BY23，或者CICC 32253；

所述YHR094C基因的Gene ID為：856494，序列如SEQ ID NO.1所示；

所述YOR185C基因的Gene ID為：854357，序列如SEQ ID NO.2所示；

所述YGR088W基因的Gene ID為：852979，序列如SEQ ID NO.3所示；

本發明的另一目的在于提供上述高產核酸釀酒酵母工程菌的構建方法，所述高產核酸釀酒酵母工程菌是通過將YHR094C基因的上游同源序列﹑篩選標記基因KanMX﹑強啟動子 (PGK1)﹑YHR094C基因﹑終止子(PGKt)以及YHR094C基因的下游同源序列片段，通過醋酸鋰化學轉化法導入宿主菌株中，將強啟動子插入到目的基因之前，達到基因過表達的目的；將YOR185C和YGR088W基因兩端的同源序列與篩選標記基因KanMX通過醋酸鋰化學轉化法轉入待改造的菌株中，KanMX基因替代待敲除基因從而實現基因的敲除。

具體步驟如下：