[發明專利]新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法

在審

• 申請號: 202011211644.7
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112280794A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 雍金貴;張倫;韋偉洋;孫偉
• 申請（專利權）人: 安徽環球基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/70;C07K14/165
• 代理公司: 合肥正則元起專利代理事務所(普通合伙) 34160
• 代理人: 周衛

1.新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：通過基因合成技術將重組N蛋白基因亞克隆克隆到pet28a載體中，合成重組N蛋白質粒，取1-2μL重組N蛋白質粒加入至含有100μL的大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)感受態細胞的EP管A中，將EP管A置于冰上靜置30min后，在溫度為42℃的條件下熱激90s，再置于冰上靜置5min；

步驟二：在EP管A內加入500μL已滅菌的無抗LB培養基后，將EP管A在溫度為37℃、轉速為220rpm的條件下振蕩培養1h，然后在轉速為3000-4000rpm的條件下將培養物離心，棄去上清液，將沉淀物涂于含有正確抗生素的LB平板上，將LB平板正置于溫度為37℃的培養箱中培養30min，然后將LB平板倒置，培養過夜；

步驟三：取試管，加入4mL含有正確抗生素的LB培養基，從LB平板挑取長勢正常的單克隆菌斑置于試管中，將試管置于溫度為37℃的搖床中以轉速220rpm的條件下進行培養，取已滅菌的1.5mLEP管B，并在EP管B中加入500μL已滅菌的質量分數為50％的甘油；

步驟四：制作保種菌；

步驟五：制備誘導前樣品；

步驟六：制備誘導后樣品；

步驟七：取保種菌進行放大誘導、純化。

2.根據權利要求1所述的新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法，其特征在于，步驟四所述制作保種菌的具體過程如下：

當步驟三中的試管中的培養物OD600＝0.6-0.8，取出試管，從試管中取出500μL培養物加入至EP管B中，將1.5mLEP管B放入-4℃保存，后期用做保種菌。

3.根據權利要求1所述的新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法，其特征在于，步驟五所述制備誘導前樣品的具體過程如下：

從步驟三中的試管中取出500μL添加IPTG溶液前的培養物置于1.5mLEP管C中，在轉速為12000rpm的條件下離心5min，棄去上清液，用80μL1×PBS緩沖液重懸沉淀，再向EP管C內加入20μL5×Protein Loading Buffer緩沖液混勻，以制備誘導前樣品。

4.根據權利要求1所述的新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法，其特征在于，步驟六所述制備誘導后樣品的具體過程如下：向步驟三中的試管的剩余培養物中加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG溶液，然后將試管在溫度為37℃、轉速為220rpm的條件下振蕩誘導4h后，從試管中取出200μL培養物,置于1.5mLEP管D中，在轉速為12000rpm的條件下離心5min，棄去上清液，用80μL1×PBS重懸沉淀，再向EP管D內加入20μL 5×Protein Loading Buffer緩沖液混勻，以制備誘導后樣品；

利用SDS-PAGE電泳技術檢測蛋白的表達，如表達，將保種菌置于-80℃以長期保存。

5.根據權利要求1所述的新冠重組NP蛋白在大腸桿菌中的生產方法，其特征在于，步驟七所述取保種菌進行放大誘導、純化的具體過程如下：取步驟四制得的保種菌以1：1000的接種濃度轉接至10mL帶有對應抗生素的LB培養基中，在溫度為37℃的條件下培養過夜，得到接種培養基，取接種培養基以1：100的接種濃度轉接1L帶有對應抗生素的TB培養基，在溫度為37℃、轉速為220rpm的條件下振蕩培養至OD600＝0.6-0.8，然后在溫度為37℃、轉速為220rpm的條件下振蕩誘導4h，誘導完成后在轉速為16000rpm的條件下離心15min，收集TB培養基中的誘導后菌體進行純化，對純化后的N蛋白進行SDS-PAGE電泳技術檢測。