[發明專利]二價植物免疫蛋白AB-NAC及其應用

在審

• 申請號: 202011201856.7
• 申請日: 2020-11-02
• 公開（公告）號: CN114437231A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 孫愛友;喬長晟;王眾;王立群;孫冰;劉旻翼
• 申請（專利權）人: 蘇州乙水茉生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A01N63/50;A01P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物技術領域，具體涉及融合蛋白AB?NAC及其生產方法和應用。所述AB?NAC蛋白，是水稻黃單胞細菌的Harpin_XooN端的59個氨基酸(AB片段)和來源于互隔交鏈孢霉(Alternaria sp.)的新生多肽相關復合體α亞基(nascent polypeptide?associated complex,alpha subunit)NAC的融合體。同時具有AB和NAC兩種蛋白的功能，具有二價植物免疫蛋白的特性，其能激發煙葉產生超敏反應(HR)的枯斑面積明顯高于AB或NAC，產生了1+1＞2的效果。能快速激發植物的免疫反應，提高植物抗病能力，植物的生長速率提高50％以上。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種二價植物免疫融合蛋白，具體涉及二價融合蛋白AB-NAC，及其基因工程菌的構建、制備方法及在提高植物的免疫力和抗逆性、促進植物的發芽和生長中的應用。

技術背景：

植物先天就擁有和動物相似的免疫系統，可在病原物的誘發下，對病原侵染產生快速的防衛反應。植物免疫系統主要由兩個免疫反應構成：病原有關分子模式引發的免疫反應(PTI)和效應蛋白引發的免疫反應(ETI)。其中，PTI反應主要是由病原微生物表面的病原有關分子模式(如多糖、鞭毛蛋白等)刺激誘導，可致使植物發生非特異性的防衛反應(基礎防衛反應)；ETI反應則由植物的抗病蛋白(R蛋白)識別病原微生物產生的效應蛋白引發，可導致植物產生特異性的防衛反應。

植物免疫蛋白，又稱植物免疫誘抗劑、植物疫苗，是當前國際上生物農藥方面十分熱點的研究方向。利用了當植物被外界刺激或者處于逆境情況時，能經由調節本身的防衛和代謝系統發生免疫抗性，從而抑制或者減輕病害的再一次發生和蔓延的原理，成為了能夠取代化學農藥和肥料的生物農藥、植物疫苗。植物免疫蛋白不但能提高植物的抗病性，還能增進植物根、莖、葉生長和葉綠素合成速率，最終起到作物增產的作用，還可以通過誘發農作物產生能抵御、防控農作物病蟲害的物質，從而起到防治病蟲害的作用。

Hpal_Xoo(hrfA，HR function)基因是從水稻黃單胞細菌白葉枯致病變種中克隆到的，全長420bp，編碼的Harpin_Xoo蛋白分為三個功能域：domain for enhancing plantgrowth，DEG、domain for inducing insect resistance，DIR和domain for inducingpathogen resistance，DPR三個功能域，它們分別含有59、33和49個氨基酸。孟凡宏等人對AB片段，即所謂的DEG功能域進行了表達及活性研究。AB片段位于Harpin_Xoo的N端，全長59個氨基酸，研究發現，AB具備同全長Harpin_Xoo差不多的抗病活性，且相較于全長Harpin_Xoo而言，AB片段更容易在體外高效表達。

互隔交鏈孢霉(Alternaria sp.)是一類重要的植物病原真菌，能引起多種植物病害。從該菌中分離得到的新生多肽相關復合體(nascent polypeptide-associatedcomplex，NAC)由α-NAC和β-NAC共2個亞基組成，體內和體外實驗證實，NAC(尤其是α-NAC)可以形成一個穩定的異源復合體，其能夠在蛋白質翻譯過程中阻止新生多肽在合成之后與錯誤的蛋白分子結合。NAC具有蛋白翻譯和基因轉錄的雙重功能，同時也是新生多肽從細胞質中進入內質網和線粒體的一個橋梁。近年來，NAC在植物促生長、誘導免疫等方面的研究也取得了快速發展。如，可以增加煙草細胞中葉綠素的含量、促進植物的生長；對植物的花器官的形成和種子發育也具有明顯的促進作用；能夠增強植物在高鹽、干旱等脅迫環境下的生存能力；促進植物體內苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等的生成，顯著激發植物的免疫反應等。

無論是hrfA基因表達的AB植物免疫蛋白，還是NAC基因表達的NAC蛋白以及NAC的衍生物，對植物的免疫激發受體、免疫激發傳導路徑和植物促生長等方面都有各自的局限性。開發更全面、性能更強的免疫蛋白，且兼有促生長功能的融合蛋白勢在必行。