[發明專利]一種體外自然殺傷細胞免疫活性的評價方法及其應用

在審

• 申請號: 202011173457.4
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112301086A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 羅浦文;姜晶;陳凱
• 申請（專利權）人: 上海睿鈺生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種體外自然殺傷細胞免疫活性的評價方法及其應用。所述評價方法中，將攜帶熒光標記A的靶細胞與自然殺傷細胞共培養，再使用熒光標記B對共培養后產生的死細胞進行染色標記，而后分別使用明場、熒光標記A匹配的熒光通道和熒光標記B匹配的熒光通道對染色標記后的細胞進行顯微成像，得到顯微圖像，再通過圖像識別對所得到的顯微圖像中的細胞進行識別，并將同一區域的識別結果進行疊加合成分析，根據分析結果評估所述自然殺傷細胞的免疫活性。本發明中采用由圖像直接得到檢測結果的“直讀法”，檢測結果更加準確直觀，適用于標準化要求較高的醫療診斷和生物醫藥產業化等領域。

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，涉及一種體外自然殺傷細胞免疫活性的評價方法及其應用。

背景技術

體外自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)的免疫活性評價對腫瘤、血液病、感染性疾病、免疫性疾病、器官移植等病因的分析、治療監控、預后情況及轉歸等方面都有重要的指導意義。NK細胞主要存在于外周血、脾臟和骨髓中，淋巴結中含量極少。其不同于T細胞和B細胞，對靶細胞殺傷時既不需特異性抗體參加，也不需抗原預先致敏，即可對多種腫瘤細胞或感染細胞有迅速殺傷和溶解作用。

NK細胞活性可作為判斷機體抗腫瘤和抗病毒感染的指標之一。在血液系統腫瘤、實體瘤、免疫缺陷病、艾滋病和某些病毒感染患者，NK活性減低；宿主抗移植物反應者，NK活性升高。因其與多種疾病的發生、發展及治療轉歸密切相關，所以NK細胞的殺傷效力可以較大程度地反映機體的細胞免疫功能。

研究表明，多數腫瘤患者特別是中晚期及伴有轉移的癌癥患者，淋巴細胞的自然殺傷細胞活性往往降低，并隨著腫瘤的發展進一步下降。癌癥患者手術后，如果NK細胞活性繼續低下，預示著腫瘤呈進行性生長或轉移，相反如果NK活性恢復正常，預示治療有效且預后良好。此外，白血病患者、器官移植患者、習慣性流產患者生理機能的相應變化，都能在NK細胞活性指標上得到明顯體現。因此，這一指標對診治多種疾病以及判斷預后都有很大幫助。

常用的NK細胞殺傷檢測方法包括：51Cr釋放試驗、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法和Calcein釋放實驗等。其中經典的方法是51Cr釋放實驗，該方法可重復性好，但是因其使用同位素標記靶細胞，從而存在半衰期短、同位素廢棄物處理及實驗防護要求高等多種限制因素，尤其是放射性同位素的使用對健康以及環境具有巨大威脅，使該類方法的應用受到局限，因此，很多研究者會采用其它替代方法進行生物學效力檢測。

但是目前，用于檢測NK細胞殺傷效力的方法都是通過釋放物質的量來間接測定的，即先用某一試劑對靶細胞進行標記，然后和不同濃度的NK細胞進行共孵育，當靶細胞受到NK細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，這些物質會釋放到上清中，通過測定釋放物質的含量可以測定NK細胞的活性。這些方法不能直接反應細胞的變化，且反應時間的長短、儀器檢測的時間點都會對讀取的數值造成影響。

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是一種在液流系統中快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術。例如，CN104928243A公開了一種實體瘤患者自體NK細胞分離、活化擴增及活性檢測方法。其中，NK細胞活性檢測方法中使用熒光標記CFSE標記靶細胞，效靶細胞共培養后再使用流式細胞儀分析細胞殺傷率，該方法可以在單個細胞水平檢測細胞的殺傷功能，在過繼免疫細胞治療腫瘤的臨床應用前基礎研究方面具有重要意義。但是，流式細胞術存在一定的缺陷，其檢測過程受操作人和分析人的主觀誤差影響較大，且檢測結果不直觀，無法直接重復驗證檢測結果的準確性，若需要驗證結果的準確性，還需要借助顯微鏡或其他儀器觀察進行佐證。

因此，本領域亟需提供一種基于顯微圖像識別、直觀可視并且準確的評估方法來評價NK細胞等免疫細胞的殺傷活性。

發明內容