[發明專利]一種體外自然殺傷細胞免疫活性的評價方法及其應用

在審

• 申請號: 202011173457.4
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112301086A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 羅浦文;姜晶;陳凱
• 申請（專利權）人: 上海睿鈺生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64;G01N15/14
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種體外自然殺傷細胞免疫活性的評價方法，其特征在于，所述評價方法包括如下步驟：

(1)將攜帶熒光標記A的靶細胞與自然殺傷細胞共培養，再使用熒光標記B對共培養后產生的死細胞進行染色標記；

其中，熒光標記A與熒光標記B對應的激發光波長不同；

(2)分別使用明場、熒光標記A匹配的熒光通道和熒光標記B匹配的熒光通道對染色標記后的細胞進行顯微成像，得到顯微圖像；

(3)通過圖像識別對所得到的顯微圖像中的細胞進行識別，并將同一區域的識別結果進行疊加合成分析，根據分析結果評估所述自然殺傷細胞的免疫活性；

其中，所述疊加合成分析過程中，僅顯示熒光標記A的細胞為活的靶細胞，僅顯示熒光標記B的細胞為死的自然殺傷細胞，同時顯示熒光標記A和熒光標記B的細胞為死的靶細胞，無熒光標記的細胞為活的自然殺傷細胞。

2.根據權利要求1所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)中所述熒光標記A包括熒光蛋白或細胞染料；

優選地，所述熒光蛋白包括綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或熒光素酶中的任意一種；

優選地，步驟(1)中使用熒光標記A對靶細胞進行染色標記后，還包括洗滌的操作；

優選地，步驟(1)中所述熒光標記B包括死細胞染料。

3.根據權利要求1或2所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)中所述靶細胞包括病毒感染的細胞和/或免疫細胞靶向的腫瘤細胞；

優選地，步驟(1)中所述靶細胞包括免疫細胞靶向的腫瘤細胞和/或病毒感染的細胞；

優選地，步驟(1)中所述靶細胞包括無熒光蛋白標記或有熒光蛋白標記的K562細胞、Jurkat細胞或神經母細胞瘤細胞中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，步驟(1)中所述自然殺傷細胞包括人外周血PBMC細胞、從組織中分離純化得到的NK細胞或經體外擴增培養的NK細胞中的任意一種或至少兩種的組合。

4.根據權利要求1～3任一項所述的評價方法，其特征在于，步驟(1)中將靶細胞與自然殺傷細胞共培養時，還分別單獨培養靶細胞和自然殺傷細胞作為對照組。

5.根據權利要求4所述的評價方法，其特征在于，所述評價方法還包括如下步驟：

對所述對照組分別使用明場、熒光標記A匹配的熒光通道和熒光標記B匹配的熒光通道進行顯微成像，得到顯微圖像；

對所述對照組的顯微圖像進行圖像識別，并將識別結果進行疊加合成分析，得到對照組的靶細胞死亡率和/或對照組的自然殺傷細胞死亡率。

6.根據權利要求1～5任一項所述的評價方法，其特征在于，步驟(3)所述識別結果包括細胞的位置信息、尺寸信息或熒光強度中的任意一種或至少兩種的組合。

7.根據權利要求1～6任一項所述的評價方法，其特征在于，步驟(3)所述分析結果包括：

靶細胞和自然殺傷細胞總數、活靶細胞數、死靶細胞數、活自然殺傷細胞數、死自然殺傷細胞數、靶細胞死亡率或自然殺傷細胞死亡率中的任意一種或至少兩種的組合；

優選地，步驟(3)所述評估的方法為：

將所述分析結果中的靶細胞死亡率與死亡率閾值進行比較，所述死亡率閾值包括上限和下限，并根據比較結果得到所述自然殺傷細胞的免疫活性水平。

8.根據權利要求7所述的評價方法，其特征在于，所述靶細胞死亡率采用如下公式進行計算：

靶細胞死亡率＝死靶細胞數/(活靶細胞數+死靶細胞數)×100％；

優選地，所述自然殺傷細胞死亡率采用如下公式進行計算：

自然殺傷細胞死亡率＝死自然殺傷細胞數/(活自然殺傷細胞數+死自然殺傷細胞數)×100％。