[發明專利]一種基于恒溫法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的試劑盒

在審

• 申請號: 202011173184.3
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112481396A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 高芳;肖艷文;徐行勇
• 申請（專利權）人: 廣州迪澳生物科技有限公司;廣州迪澳醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 廣州正明知識產權代理事務所(普通合伙) 44572
• 代理人: 張麗

本發明屬于生物醫藥技術領域，公開了種基于恒溫法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的試劑盒，本發明以rpoB基因作為檢測靶點，并對該突變區域設計合成四條分子信標探針，通過四條探針的聯合作用，利用溶解曲線法實現對突變基因的篩查達到檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的效果；采用本發明的試劑盒進行檢測，簡單快速，只需要1個小時即可判斷樣本是否對利福平耐藥，同時還能檢測樣品是否為結核分枝桿菌；靈敏度高，最低可檢測100CFU/mL的結核分枝桿菌；本發明設計了四條分子信標探針，基本覆蓋了利福平耐藥相關基因的突變位點；本發明對于臨床使用利福平對肺結核的治療用藥有重要的參考價值，適合推廣使用。

技術領域

本發明涉及分子診斷技術領域，更具體地，涉及一種基于恒溫法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的試劑盒。

背景技術

結核分枝桿菌是引起結核病的主要致病菌。根據2018年世界衛生組織全球結核病報告，8個國家的結核病病例數占全球總數的2/3,而我國占到其中第二位(9％)。2018年全球新增約50萬利福平耐藥結核病病例，其中我國新增耐多藥結核病和利福平耐藥結核病患者約7萬人，因此耐藥結核仍然是一項公共衛生威脅。

當前臨床上檢測結核分枝桿菌利福平耐藥常用的方法有細菌培養法和PCR核酸檢測法。其中基于培養的藥敏檢測的主要缺點是耗時長(一般需要28～42天，采用BACTCMGIT960快速液體培養基也需要10～14天)，操作繁瑣，檢測成本高。而基于核酸檢測的PCR熒光曲線技術具有較高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率較高。同時，樣本中往往含有抑制PCR反應的成分也會導致假陰性的出現，限制了PCR技術的臨床應用。由此可見，結核分枝桿菌利福平耐藥的的診斷，急需更簡潔，靈敏的快速檢測方法。

現已經證實結核分枝桿菌利福平耐藥與RNA聚合酶的β亞基編碼基因rpoB的突變有關，其中絕大部分(95％)的突變都發生在rpoB上的507～533密碼利福平耐藥決定區域上，通過檢測相關區域基因突變情況，就可給出耐藥信息。

現有檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的技術檢測時間長，檢測特異性和靈敏度不夠，不利于基層檢測人員的普及。

發明內容

為了克服現有技術存在的上述缺陷，本發明的首要目的是提供一種用于結核分枝桿菌ropB基因環介導恒溫擴增的檢測引物組。

本發明的第二個目的是提供一種用于篩查ropB突變區域的分子信標。

本發明的第三個目的是提供一種基于恒溫法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的試劑盒。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種用于結核分枝桿菌ropB基因環介導恒溫擴增的檢測引物組，所述檢測引物組包括外引物對F3/B3、內引物組FIP-1/FIP-2/FIP-3/FIP-4/BIP、環引物LB；其中，F3/B3的序列如SEQ ID NO：1～2所示，FIP-1/FIP-2/FIP-3/FIP-4/BIP的序列如SEQ ID NO：3～7所示；LB的序列如SEQ ID NO：8所示。

本發明還提供一種用于篩查ropB突變區域的分子信標rpoB-M1、rpoB-M2、rpoB-M3、rpoB-M4，所述分子信標的序列如SEQ ID NO：9～12所示。

本發明還提供一種基于恒溫法檢測結核分枝桿菌利福平耐藥的試劑盒，含有所述的檢測引物組和分子信標。

優選地，所述試劑盒還包括反應液、DNA聚合酶、陽性對照和陰性對照。

更優選地，所述反應液包含10mM dNTPs、10×ThermoPol反應緩沖液和100mMMgSO₄水溶液，三者的體積比是7：5：3。

更優選地，所述陽性對照為含有ropB基因DNA片段的T載體克隆，所述陰性對照為超純水。

優選地，試劑盒進行PCR擴增的程序為：