[發(fā)明專利]一種用于細(xì)胞誘導(dǎo)自組織成多細(xì)胞球的3D凝膠載體及多細(xì)胞球培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011172644.0
• 申請(qǐng)日: 2020-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN112522199A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李冬冬;訾紅彥;戴仕奎;周飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京英瀚斯生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/09
• 分類號(hào): C12N5/09;C08J3/24;C08L71/02;C08L89/00
• 代理公司: 南京蘇創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32273
• 代理人: 王華

本發(fā)明公開了一種用于細(xì)胞誘導(dǎo)自組織成多細(xì)胞球的3D凝膠載體及多細(xì)胞球培養(yǎng)方法，本方法與傳統(tǒng)不同，本發(fā)明通過控制抗/促細(xì)胞粘附成分的比例，基于PEGDA/GelMA粘附位點(diǎn)控制材料表面的細(xì)胞粘附位點(diǎn)密度，使細(xì)胞存在于有限粘附的微環(huán)境之中，自組織形成多細(xì)胞球，最大程度的模擬了腫瘤細(xì)胞組織的生理作用及其環(huán)境，更接近真實(shí)生物環(huán)境最終自組織形成多細(xì)胞球。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及3D腫瘤細(xì)胞成球技術(shù)。

背景技術(shù)

藥物篩選是指利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法和技術(shù)，建立合適的篩選模型，從可能作為藥物使用的天然或合成化合物中得到高效的先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行藥理及藥效活性的檢測，評(píng)價(jià)某一化合物的藥用前景的方法，是新藥研發(fā)中縮短時(shí)間、減少成本和降低風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的細(xì)胞篩選模型所利用的細(xì)胞通常是由病理部位細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)等手段得到的單層細(xì)胞或單細(xì)胞的懸浮液，呈平面生長，缺乏細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的接觸，細(xì)胞所處的環(huán)境與實(shí)體微環(huán)境截然不同。同氨基酸的盤曲折疊形成不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)功能不同一樣，細(xì)胞的堆積方式不同，它的特性也不盡相同，通過普通的平面2D細(xì)胞篩選得到的結(jié)果不能非常準(zhǔn)確地反應(yīng)藥物在人體內(nèi)的作用效果。例如，多年來癌癥藥物的發(fā)現(xiàn)主要是基于它對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力和精確抑制癌細(xì)胞基因的能力，這些化合物在使腫瘤部分或完全消退的同時(shí)，會(huì)伴隨著大量的細(xì)胞毒性累積。而利用2D篩選模型得到的抗癌藥物在殺滅病理細(xì)胞之后，積累的毒性可能會(huì)轉(zhuǎn)而攻擊周圍的正常細(xì)胞。這使得大部分的抗癌藥物后期都無法通過臨床試驗(yàn)，浪費(fèi)了大量的人力、物力與時(shí)間。所以，2D細(xì)胞篩選模型已經(jīng)無法滿足人們的需要。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，人們致力于開發(fā)能更好地代表體內(nèi)生物學(xué)的3D培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)腫瘤模型，同時(shí)更趨向于大批量和小型化。

現(xiàn)有主流的體外藥效的評(píng)價(jià)方法是采用3D腫瘤成球技術(shù)，其依賴于通過剝奪細(xì)胞與培養(yǎng)皿間的粘附，迫使腫瘤細(xì)胞被動(dòng)成球(如圖1所示)，但該方法存在以下缺陷：(1)一些細(xì)胞只能形成松散的聚集體，而不能形成具有生理屏障的多細(xì)胞球，因此某些腫瘤細(xì)胞無法實(shí)現(xiàn)真正的三維培養(yǎng)。(2)這種方法給細(xì)胞提供的無粘附微環(huán)境在體內(nèi)并不常見，無法真實(shí)模擬體內(nèi)環(huán)境。(3)整個(gè)人體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)有很大差異，從細(xì)胞外環(huán)境的結(jié)構(gòu)和生化組成來看，是每個(gè)器官高度特異性，因此無法真實(shí)模擬體內(nèi)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的就是提供了一種用于細(xì)胞誘導(dǎo)自組織成多細(xì)胞球的3D凝膠載體及多細(xì)胞球培養(yǎng)方法，

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種用于細(xì)胞誘導(dǎo)自組織成多細(xì)胞球的3D凝膠載體，通過以下方法制備獲得：

首先，將交聯(lián)劑BIS、抗細(xì)胞粘附組分A和促細(xì)胞粘附組分B，加入PBS溶液中，然后加入交聯(lián)引發(fā)劑，在振蕩或攪拌條件下水浴加熱至50-60℃完全溶解得到水凝膠溶液；

然后，將水凝膠溶液注入透明模具中，控制溫度在20-35℃，進(jìn)行波長為405nm的光照，發(fā)生固化反應(yīng)得到3D凝膠；

最后，將得到3D凝膠浸入PBS溶液中，并通過環(huán)氧乙烷進(jìn)行滅菌處理，備用；

所述抗細(xì)胞粘附組分為PEGDA、丙烯酰胺或聚乙烯醇；所述促細(xì)胞粘附組分為GelMA、丙烯酰氨基膠原、丙烯酰氨基纖維蛋白原。

進(jìn)一步的，所述交聯(lián)引發(fā)劑為LAP。

本發(fā)明還提供了一種結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO的多細(xì)胞球培養(yǎng)方法，將結(jié)直腸癌細(xì)胞LOVO 以0.1-0.2X10⁶的密度接種在上述3D凝膠載體的表面，并置于培養(yǎng)液中，在溫度為37±2℃， 4-5％二氧化碳濃度的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，每兩天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至少7天后，完成多細(xì)胞球結(jié)構(gòu)培養(yǎng)；其中，在制備3D凝膠載體過程中，水凝膠溶液中添加的PEGDA、GelMA和交聯(lián)劑BIS的質(zhì)量比分別為10％、10％、0.5％。