[發明專利]粉紅單端孢菌高產單端孢菌素的方法及其在制備闊葉雜草除草劑中的應用

有效

• 申請號: 202011172612.0
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112301070B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 方偉;吳兆圓;劉芳;張志剛;張亞妮;萬中義;王開梅
• 申請（專利權）人: 湖北省生物農藥工程研究中心
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N1/14;A01N43/90;A01P13/00;C12R1/645
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于微生物農藥技術領域，公開了粉紅單端孢菌高產單端孢菌素的方法及其在制備闊葉雜草除草劑中的應用。本發明開發了一種適用于粉紅單端孢菌發酵高產的單端孢菌素的培養基，所述的粉紅單端孢菌的保藏編號為CCTCC NO：M2019210。該培養基組分易得，廉價，對于單端孢菌素的產量有極大的提高，比常規培養基提高了200%。本發明實現了直接將粉紅單端孢菌發酵液用于制備闊葉雜草除草劑的工業目的，適用于大規模推廣。

技術領域

本發明屬于微生物農藥技術領域，具體涉及粉紅單端孢菌高產單端孢菌素的方法及其在制備闊葉雜草除草劑中的應用。

背景技術

隨著社會文明的進步和公眾健康意識的提高，廣泛、長期、大量使用化學除草劑所帶來的負面影響日益顯現，倍受全球關注。利用自然界生物中具有生物活性的代謝產物開發新的生物源除草劑是除草劑研發的一個重要途徑和未來發展方向。因為這類化合物往往具有化學結構新異，作用靶點獨特，廣譜、低毒、低殘留的特點，且受環境影響較小。另外，相對于開發一個新的化學除草劑產品需要耗時10年、花費約2.5億美元的財力狀況，這種利用天然產物研發新除草劑的方式具有定向性、研制周期短、研發費用相對低廉的優點。近年來, 以微生物天然產物開發生物源除草劑或新穎除草劑的先導化合物引起了雜草科學家和農藥化學家的極大興趣，最成功的是雙丙氨磷(bialaphos)和草銨膦(phosphinothricin)。

關于粉紅單端孢菌NBERC_49006，是申請人在篩選除草活性天然產物過程發現一株粉紅單端孢菌NBERC-49006的乙酸乙酯提取物顯示良好的抑制種子萌發作用，并且分離得到一個活性化合物單端孢菌素(Trichothecin)(吳兆圓等，天然產物研究與開發，2019(31)， 1772-1776)，在該文章中公開了單端孢菌素(Trichothecin)對擬南芥種子的抑制能力為 LC₅₀9.30ug/ml，但用單端孢菌素為32ug/ml的測試濃度測試狗牙根的萌發情況時，發現其不能抑制，說明其對狗牙根種子的起效濃度大于32ug/ml，或者其對狗牙根種子不起作用。而對擬南芥能其作用的除草劑，在實際生產中，并沒有太大的借鑒作用，擬南芥是一種模式植物，在除草劑的篩選中具有高敏感性的特點，但是對雜草的除草實驗缺乏一致性，很有可能導致假陽性的結果(張志剛等，湖北農業科學，2014(53)：5371-5373)因此，在考慮到生物除草的生產成本以及除草效果的情況下，依然亟待開發一種可發酵后直接可用于除草的生物菌劑。

發酵培養基的配方是發酵工業中非常關鍵的因素，其直接影響代謝產物的產量以及后續的生產成本。盡管現有的發酵培養基很多，也有很多成功的范例，但是由于微生物菌種的多樣性，不同菌種之間配方沒有參考和借鑒意義。例如，對于多殺菌素的產生菌，采用的優化配方為葡萄糖50g/L，麥芽糖10g/L，棉籽粉20g/L，硫酸銨1g/L，硫酸鋅0.2g/L，玉米漿15g/L,牛肉膏2g/L，碳酸鈣5g/L，產量提高31.6％(朱明軍等，農藥，2009(48)：728-731)；而對阿維菌素的發酵，較好的配方為淀粉12％，豆餅粉2.5％，酵母粉1％，氯化鈷0.004％，碳酸鈣0.08％，還原糖初始濃度1-2％(陳萬河，浙江工業大學，2008)，兩者的培養基配方完全不一樣。

在發酵培養基的篩選中，影響比較顯著的成分有碳源、氮源、無機鹽以及一些微量元素。目前可以用于工業生產的碳源、氮源、無機鹽等種類非常多，特別是碳源和氮源來源通常為天然的組分，這些組分對于產物產量的影響很大，也導致在篩選配方時隨機性和工作量巨大。如宋淵等人在前期工作的基礎之上，進一步篩選170余種培養基配方，才得到一個理想的培養基配方(宋淵等，中國抗生素雜志，2001(26)：176-180)。另外，由于活性代謝產物為次生代謝產物，對微生物本身為非必須化合物，一般使其大量代謝產生均存在一定困難，如多殺菌素、洛伐他汀等發酵培養基優化，其產量增加17-56％之間(吳波等.中國抗生素雜志， 2007(07):409-413；胡旭曄等，中國醫藥工業雜志,2007,38(2):90-93；朱明軍等，農藥， 2009,48(10):728-731.)。

發明內容