[發明專利]干酪乳桿菌Zhang的VBNC態的誘導以及VBNC態細胞脂肪酸的檢測方法

在審

• 申請號: 202011172570.0
• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112210517A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 包秋華;郭麗茹;王俊國;張猛;代麗霞;馬學波
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/00;G01N30/02;G01N30/06;C12R1/245
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發明提供了干酪乳桿菌Zhang的VBNC態的誘導方法以及VBNC態細胞膜脂肪酸的檢測方法，屬于微生物培養技術領域，所述誘導方法包括以下步驟：將所述干酪乳桿菌Zhang接種于液體MRS培養基中活化后接種到MRS誘導液中于3.5～4.5℃進行VBNC態的誘導，至平板菌落計數法計活細胞數為0，并且熒光顯微鏡法計活細胞數大于0，獲得干酪乳桿菌Zhang的VBNC態。所述方法成功獲得VBNC態細胞，豐富了干酪乳桿菌Zhang的VBNC態誘導的誘導液種類。本發明還提供了提取干酪乳桿菌Zhang正常態、VBNC態的膜脂肪酸組分和含量的差異分析結果。

技術領域

本發明屬于微生物培養技術領域，尤其涉及干酪乳桿菌Zhang的VBNC態的誘導方法以及VBNC態細胞脂肪酸的檢測方法。

背景技術

“益生菌”是指經口服足夠數量后會改善宿主腸道微生物的平衡，進而對宿主健康產生有益影響的活的微生物。乳酸菌是益生菌中最具代表性的菌屬。乳酸菌和益生菌不是一個概念，乳酸菌是指革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性、能利用可發酵碳水化合物產生50％以上乳酸的一類細菌總稱。乳酸菌種類繁多，目前已發現乳酸菌包括43個屬，373個種和亞種，而且每年都有新乳酸菌種屬被分離和發現(https://lpsn.dsmz.de/domain/bacteria。不是所有的乳酸菌都可以稱為益生菌，或用做益生菌及其產品。篩選益生菌菌株、開發益生菌產品并使其商品化是國內外乳酸菌研究和科研成果轉化的一大熱點。

干酪乳桿菌Zhang(Lb.casei Zhang)(CGMCC No.1697)是從采集自內蒙古地區錫林郭勒盟自然發酵酸馬奶樣品中分離的、具有自主知識產權的、并經實驗證明的具有益生特性的乳酸菌菌種(Zhang WY等，Journal of Bacteriology,2010,192(19):5268-5269)，該益生菌和我實驗室研發的我國其他具有自主知識產權的菌株復合，推出了“益生和美”系列益生乳酸菌發酵劑和制劑產品，已應用于內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司和旗幟嬰兒乳品股份有限公司、黑龍江完達山哈爾濱乳品有限公司、云南歐亞乳業有限公司等企業進行推廣應用，并開發了益生乳酸菌飲料、中老年奶粉、酸奶、益生乳酸菌酸奶系列產品，產生了顯著的經濟效益。

益生乳酸菌被人體攝入后只有保持較高活性才能有效發揮其保健益生作用。研究表明益生菌進入消化系統后活菌含量必須達到1×10⁶CFU/mL以上才能發揮其健康功效，因此要求新鮮益生菌乳制品中活菌數量不得低于1×10⁷CFU/mL，只有這樣才能補償益生菌通過人體胃腸道時活菌數的損失。因此，益生乳酸菌發酵劑或其產品在制備、貯運和應用過程中能夠保持高的細胞活力十分重要。

然而乳酸菌在生產和應用過程中不可避免的要耐受各種環境壓力，諸如極端的溫度、酸、高溫、低溫、冷、滲透壓、氧和饑餓等，一旦受到外界環境壓力或營養條件的劇烈改變，就會發生一些變化，導致活力下降，死亡率增加。上世紀80年代初期，徐懷恕等提出有些細菌在不良環境條件下會進入活的非可培養態(Viable but non-culturable,VBNC)。VBNC態是細菌在不良的環境條件下，用常規的平板培養方法無法使菌落生長繁殖，但細菌仍具有代謝活性的一種狀態。VBNC態細菌一旦處于適宜的培養條件，仍能繼續生長繁殖。有些致病菌仍然具有毒力。這一概念在微生物領域一提出就受到了極大的關注。