[發(fā)明專利]一種從湘西酸肉中分離篩選芽孢桿菌的方法

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• 申請日: 2020-10-28
• 公開（公告）號: CN112111436A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 瞿朝霞;魏冕;曾靜朗;李裕;周錦悅;于杜;劉鑫怡
• 申請（專利權(quán)）人: 懷化學(xué)院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/07
• 代理公司: 深圳市興科達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44260
• 代理人: 殷瑜

本發(fā)明提供了一種從湘西酸肉中分離篩選芽孢桿菌的方法，以湘西酸肉為主要實(shí)驗(yàn)材料，采用一般培養(yǎng)和平板劃線分離方法分離篩選出可高效降解且耐受亞硝酸鹽的純化芽孢桿菌；從湘西酸肉中篩選出的這株芽孢桿菌有較強(qiáng)的高亞硝酸鹽降解和耐受能力，目的是將其開發(fā)成肉類專用發(fā)酵劑，提高發(fā)酵肉制品的營養(yǎng)安全性與傳統(tǒng)酸肉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為開發(fā)直投式肉用發(fā)酵劑提供優(yōu)質(zhì)菌種資源，也為低亞硝發(fā)酵肉制品生產(chǎn)帶來更大的便利和增值空間，為發(fā)酵肉制品的發(fā)展提供了廣闊前景。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從湘西酸肉中分離篩選芽孢桿菌的方法。

背景技術(shù)：

酸肉是一類有著悠久歷史的發(fā)酵肉制品；湘西酸肉是由豬肉、食鹽和糯米在一定條件下經(jīng)微生物長期發(fā)酵及其酶法發(fā)酵作用而成的，發(fā)生了復(fù)雜而深刻的化學(xué)變化，所以可開壇即食，食之鮮嫩。少數(shù)民族地區(qū)特色性的酸肉為發(fā)酵類肉制品，流行于苗族、侗族、布依族等地，有“吃不離酸”和“三天不吃酸，走路打亂竄”的俗語；由于酸肉營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特和保質(zhì)期長而成為許多少數(shù)民族喜愛的一類發(fā)酵肉制品；硝酸鹽和亞硝酸鹽是經(jīng)常使用到的兩種食品添加劑，硝酸鹽在微生物還原酶的作用下可變成為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽容易使肉類蛋白質(zhì)分解，生成亞硝胺等強(qiáng)致癌物；在發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)中為確保肉制品的質(zhì)量安全，食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)明確規(guī)定，肉制品的亞硝酸鹽添加含量應(yīng)≤0.15g/kg，殘留含量應(yīng)≤0.03g/kg；肉制品的硝酸鹽添加含量應(yīng)≤0.5g/kg，殘留含量應(yīng)≤0.03g/kg，實(shí)際上，即使生產(chǎn)中亞硝酸鹽添加量符合國家標(biāo)準(zhǔn)，肉制品中的亞硝酸鹽殘留量仍會出現(xiàn)大量超標(biāo)現(xiàn)象，可能的影響因素有溫度、腌制時間、原材料新鮮程度和肥瘦比例等。

酸肉中富含酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等微生物，這些微生物是篩選肉用發(fā)酵劑菌株的重要生物資源，具有很大的開發(fā)潛力；正是由于這一種巨大的市場開發(fā)潛力，探究出酸肉制品的發(fā)酵菌種與其理化成分自身轉(zhuǎn)變特性之間的相關(guān)性，揭示出傳統(tǒng)酸肉中微生物與其產(chǎn)品質(zhì)量之間的內(nèi)在聯(lián)系，是酸肉發(fā)酵體系中營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)變與微生物的優(yōu)勢有益菌種進(jìn)行研究和分析的有必要性；革蘭氏陽性菌芽孢桿菌是一類能產(chǎn)生抗力內(nèi)生孢子的細(xì)菌，細(xì)胞呈桿狀，具圓端或方端，常以成對或鏈狀排列；芽孢桿菌在自然界中分布十分廣泛，存在于水、土壤、空氣以及動物腸道等處，甚至更惡劣的環(huán)境中都有存在；與其他微生物活菌制劑相比，芽孢桿菌在惡劣的環(huán)境下能形成芽孢(內(nèi)生孢子)將自己保護(hù)起來，在條件適宜時又可以重新萌發(fā)成營養(yǎng)體，它們對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，具有復(fù)活率高、耐酸堿、耐高溫高壓、快速復(fù)活和較強(qiáng)分泌酶等特點(diǎn)，在有氧和無氧條件下都能存活，因而在環(huán)保、農(nóng)業(yè)和工業(yè)生產(chǎn)、食品加工和保鮮等方面具有較高的應(yīng)用，目前為了減少亞硝酸鹽在發(fā)酵肉制品中的殘留，通常采用的是加入抗壞血酸等添加劑的化學(xué)方法與加入乳酸菌等有益菌種的生物方法，但是從湘西酸肉中分離篩選出可高效降解和耐受亞硝酸鹽的芽孢桿菌作為發(fā)酵劑的研究則較少。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于改進(jìn)傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵工藝和構(gòu)建及篩選優(yōu)良性狀的有益微生物菌種，提高發(fā)酵肉制品的營養(yǎng)安全性與傳統(tǒng)酸肉產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提供一種從湘西酸肉中分離篩選出具備高亞硝酸鹽降解和耐受能力的芽孢桿菌的方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的：一種從湘西酸肉中分離篩選芽孢桿菌的方法，包括如下步驟：

步驟一：原料處理：在裝有90mL無菌水的三角瓶內(nèi)加入10g剪碎后的湘西酸肉，之后做10倍系列稀釋，每個稀釋度取0.1mL加到牛肉膏培養(yǎng)基上，適當(dāng)溫度下培養(yǎng)48h得到菌株；

步驟二：菌株的分離純化：對步驟一得到的菌株進(jìn)行革蘭氏鏡檢，觀察菌株形態(tài)，挑選出典型菌株，并經(jīng)過平板反復(fù)劃線或的菌落，經(jīng)過分離純化后得到純的目的菌株；

步驟三：菌株的初步篩選：將步驟二中得到的純的目的菌株接種于牛肉膏培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，取10％體積分?jǐn)?shù)的新鮮菌液接種于含有一定濃度的牛肉膏培養(yǎng)基中，并加入2ml對氨基苯磺酸溶液混勻，避光靜置5min，加入1ml鹽酸萘乙二胺溶液混勻，光靜置15min，挑選顏色較淺的菌株；