[發明專利]一種基于高通量測序構建目標蛋白互作網絡的方法

有效

• 申請號: 202011140853.7
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112301117B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 宋愛萍;余琪;胡月姮;張璐瑤;陳素梅;管志勇;房偉民;陳發棣
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/10;G16B5/00;G16B25/20
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

1.一種基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟：

（1）四缺培養基篩選互作蛋白：BD-誘餌與獵物文庫共轉化酵母，用YPDplus培養基30℃培養4h后，離心，棄上清，加入無菌水懸浮，獲得菌液；

取所獲得的菌液，加入SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade液體培養基中，震蕩培養24 h、72 h、80 h后分別取樣；

所述共轉化為使用MatchmakerGold酵母雙雜交系統，所述酵母為Y2H酵母菌株；

（2）分別以步驟（1）中獲得的在24 h、72 h、80 h取樣的菌液為模板，以AD-F和AD-R為引物，分別進行MightyAmp PCR擴增，獲得3個時間段菌液樣品的PCR產物；用瓊脂糖凝膠電泳檢測目標蛋白的富集程度，回收，獲得3個時間段PCR回收產物； AD-F和AD-R引物如下：

AD-F：5′-TATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3′（SEQ ID NO.1）； AD-R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′（SEQ ID NO.2）

（3）高通量測序：分別構建步驟（2）所得到3個時間段PCR回收產物的測序文庫，進行高通量測序，測序模式為PE150，測序量不少于6G，得到原始reads；

（4）獲取目標蛋白所屬物種的基因集序列和文庫基因豐度數據，篩選差異基因，獲得目標蛋白的互作蛋白編碼基因集：

（4-1）將步驟（3）中3個時間段PCR回收產物的測序文庫測序所得的原始reads去除接頭和3’端的AD-F與5’端的AD-R后，將所有數據合并，進行從頭組裝，獲得目標蛋白所屬物種的基因集序列；

（4-2）對步驟（3）中構建的3個時間段測序文庫分別進行文庫基因豐度檢測，篩選出差異基因，所述差異基因為在后一時間點的文庫基因豐度高于前一時間點文庫基因豐度的基因，共獲得3組差異基因集；

（4-3）篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集：將篩選得到的3組差異基因集作為初步篩選的目標蛋白的互作蛋白編碼基因集，繪制維恩圖，獲得的3組差異基因集的交集，交集中的基因即為目標蛋白的互作蛋白編碼基因集。

2.根據權利要求1所述的基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于所述離心條件為2000rpm離心5min；震蕩培養條件為30℃ 200 rpm震蕩培養。

3.根據權利要求1所述的基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于，步驟（2）所述PCR擴增體系為：12.5 μL 2X Mighty Amp buffer，1 μL 上游引物AD-F，1 μL 下游引物AD-R，0.25 μL Mighty Amp DNA Polymerase，1μL 三個時間段取樣菌液，9.25 μL水；

PCR擴增程序為98℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 3 min，循環35次；68℃ 5min；4℃ ∞。

4.根據權利要求1所述的基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于，步驟（2）所述回收為：參照MiniBEST DNA Fragment Purification KitVer.4.0試劑盒提供的方法進行PCR產物回收。

5.根據權利要求1所述的基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于，步驟（3）所述高通量測序采用第二代測序儀Novaseq 6000 。

6.根據權利要求1所述的基于高通量測序篩選目標蛋白的互作蛋白編碼基因集的方法，其特征在于，步驟（4-1）所述從頭組裝采用Trinity-v2.4.0軟件包，組裝參數為--min_glue 2 --min_kmer_cov 4。